电针治疗周围神经损伤后损伤局部差异表达基因分析*

车文文，郭永明，王 丹，赵舒蒙，郭 义，章明星

（1.天津中医药大学实验针灸学研究中心，天津 301617；2.天津中医药大学中医学院，天津 301617；3.天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617）

周围神经损伤（PNI）是临床常见疾病，交通事故是导致PNI 的主要原因[1]。虽然周围神经损伤后可以再生，但是其结构比较复杂，致使周围神损伤后的功能恢复率只能达到损伤前的70%左右[2]。PNI还会导致骨骼肌失去神经支配，长期失神经状态则会引起肌容量丧失、肌纤维重构，肌卫星细胞减少等病理改变，最终造成不可逆的失神经性肌萎缩，致使运动功能恢复不理想[3-4]。近些年来神经修复水平有了明显的提高，但神经功能恢复效果仍不尽如人意。大量研究表明电针疗法对PNI 治疗效果显著[5]。团队前期研究结果已表明电针治疗周围神经损伤有效[6-7]。然而，电针对PNI 治疗作用的具体机制尚不完全明确，还需要进一步的研究。高通量转录组测序技术是从转录组水平来研究基因表达谱的一个新的技术手段，其凭借高灵敏度、高通量和低成本的优势成为从全基因组水平研究基因表达的主要方法[8]。本研究利用高通量测序技术对坐骨神经损伤局部神经组织进行转录组测序，并结合生物信息学技术对获得的差异表达基因开展功能注释、信号通路分析等方面的研究，以进一步阐明电针治疗周围神经损伤的作用机制，为电针进一步推广应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 依据文献报道和实验动物“3R 原则”，本实验选取Wistar 大鼠9 只[4-5]，雄性，8 周龄，SPF 级，随机分为空白组、模型组、电针模型组，对电针模型组、模型组建立坐骨神经横断伤模型，电针刺激患侧环跳（+）、足三里（-），电针参数：输出频率5 赫兹，断续波，15 min，强度以患肢轻微颤动为度。电针6 d 后，在坐骨神经横断伤处，以损伤处为中心取1 cm 长的神经组织样品，并迅速置于液氮中，然后放入-80 ℃超低温冰箱内冷冻保存，用于RNA 提取和转录组测序。

1.2 测序方法 进行样品的total RNA 抽提，后纯化total RNA，再进行质检，质检合格的RNA 可进行后续的测序实验。对纯化后的total RNA 进行rRNA去除、片段化、第1 链cDNA 合成、第2 链cDNA 合成、末端修复、3'末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建，文库质检合格后进行上机测序，进行双端测序。对测序得到的raw reads 进行质控。所有的样品测序量都满足质控标准后进行数据分析。

2 结果

2.1 差异表达基因 以P≤0.05、Fold-change≥2为条件，筛选3 个样本的差异表达基因。模型组与空白组相比，检测到4170 个显著性差异基因，下调差异基因3 001 个，上调差异基因1 169 个（图1）。电针模型组和模型组相比，检测出104 个显著性差异基因，80 个差异基因下调，24 个差异基因上调（图2）。其中有69 条基因造模后表达趋势与电针后表达趋势相反，62 条基因造模后表达上调，经过电针后表达下调，7 条基因造模后表达下调，经过电针后表达上调，因此这69 个基因是3 组共同差异表达基因，其在模型制备以及电针干预后均发生显著的差异表达。这些差异基因中经过电针刺激后，上调最明显的5 个基因为：Igh-1a、Igkc、Ncald、Igf2、Has3；下调最明显的5 个基因为：Tchh、AABR07052585.1、Myh1、Mylpf、Actn3。

2.2 差异表达基因GO 功能注释及显著性分析 基因本体论（GO）是一个国际标准化的基因功能分类系统，提供了一个全面描述生物体的基因属性和基因产物的动态更新词汇库[11]。将模型组与空白组、电针模型组与模型组的差异基因做GO 功能分类统计，从生物工程（biological process，BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3 个方面进行基因功能分析，筛选标准为P＜0．05。

图1 空白组和模型组差异基因火山图

图2 电针模型组和模型组差异基因火山图

图3 空白组与模型组差异基因GO 分类结果

图4 空白组与模型组差异基因GO 富集结果

图5 电针模型组与模型组差异基因GO 分析结果

图6 电针模型组与模型组差异基因GO 富集结果

空白组与模型组共45 187 个基因得到了注释，BP 类别中：细胞过程、单一生物过程所含基因最多，CC 类别中：细胞、细胞部分类所占比例最高，MF类别中：结合、催化活性类所包含的基因最多；GO功能富集主要与细胞发育、迁移，信号转导、神经系统发育等相关（图3、图4）。电针模型组与模型组共92 个差异基因得到分类注释，BP 类别中细胞过程和单一生物过程包含的基因最多，在CC 类别中：细胞类、细胞部分类所占比例最高，而在MF 类别中：占主导地位的是结合类；GO 功能富集主要与钙离子结合、免疫应答、以及电压门控阳离子通道活性等过程相关（图5、图6）。

2.3 差异表达基因KEGG 通路分析 KEGG 数据库是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库。利用该数据库有助于把基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。对差异基因进行KEGG 分析，空白组与模型组差异表达基因分析主要涉及与信号转导、免疫系统、全局和概览图相关的通路。电针模型组与模型组差异表达基因主要涉及免疫系统、信号转导、细胞群落3个方面，如图7，8 所示。

对差异基因进行KEGG 通路富集，以P-value＜0．05 为标准，模型组与空白组之间的差异表达基因显著富集了53 条KEGG 信号通路。电针模型组与模型组之间的差异表达基因涉及了19 条KEGG 信号通路，去掉与研究方向无关的通路，剩余可能与研究方向相关的通路8 个，富集结果如表1 所示。

3 讨论

周围神经损伤是常见的致残性疾病，属于中医“痹症”、“痿证”的范畴，《内经》就提出“治痿独取阳明”的理论。在本次实验中，选择“环跳”、“足三里”两穴，环跳穴位于足少阳胆经上，主要用于下肢痿痹等疾病的治疗，足三里穴属于足阳明胃经，补益要穴，电针刺激环跳、足三里可促进神经功能的恢复，深刺可以增加神经生长因子的表达[12-13]。研究表明电针疗法不仅具有针刺穴位本身的作用，还可以产生弱电场，促进再生神经向阴极生长，且5 Hz 电针对于神经损伤的再生修复作用优于高频电针[14-15]。故本实验选择环跳为阳极足三里为阴极，电针参数选择断续波、5 Hz，强度以肌肉出现轻微抽动为准。

图7 电针模型组与模型组差异基因KEGG 分析结果

图8 空白组与模型组差异基因KEGG 分析结果

表1 模型组与电针组KEGG 富集通路结果

目前，针灸治疗周围神经损伤经过大量的临床和实验研究已被证明是一种行之有效的方法。大量基础研究显示，电针能够改善周围神经损伤后运动终板内的营养物质含量和结构，能够延缓肌肉的萎缩，促进神经生长相关因子的增多、促进雪旺细胞大量增生并且分泌多种神经活性物质，抑制脊髓前角和背根神经元凋亡，进而促进周围神经损伤后形态和功能恢复[16-22]。近年来学者们逐渐认识到周围神经损伤后修复与再生的微环境是决定其结局的关键，此微环境可概括为神经再生通道建立、神经营养因子调节、炎性反应、激素调节、信号通路调控及酶的调节等6 个方面，有研究表明电针对神经修复机制可能与神经损伤后神经元、轴突的再生记忆微环境的改变有关，但具体机制尚不明确，还需要进一步的研究[23-26]。高通量转录组测序技术是从转录组水平来研究基因表达谱的一个新的技术手段，现在被广泛应用于挖掘功能基因、开发分子标记、揭示代谢调控途径等方面，本研究采用该技术获取大量电针治疗周围神经损伤的转录信息，并对差异基因进行定量、定性研究，筛选电针对神经的修复机制可能激活的信号通路，进一步阐释电针的作用机制。

本实验的结果表明空白组、模型组、电针模型组间基因有显著的区别，说明电针后的大鼠在基因表达水平上存在特异表现，揭示这些差异表达基因可能在坐骨神经损伤的发生、发展中扮演重要角色。空白组与模型组共筛选出4 170 个显著性差异基因，其中3 001 个基因在模型组中表达下调，1 169 个基因在模型组中表达上调；电针组和模型组一共检测出104 个差异表达基因显著,其中24 个基因在电针组组织中表达上调，80 个基因在电针组组织中表达下调，进一步的筛选发现差异最为显著的30 个基因中，20 个为下调基因，10 个基因表达上调，表达显著上调的前5 位基因是：AABR07051592.2、Igkc、Igh-1a、Igf2、LOC100912707；表达显著下调的前5 位基因是：Acta1、Myh1、Ryr1、Myl1、Mylpf。GO富集分析结果表明电针可能是通过对免疫过程、离子通道、细胞骨架的调节而达到对周围神经损伤的治疗作用。KEGG 分析表明经过电针以后主要涉及免疫系统、信号转导、细胞群落3 个方面的变化，其中细胞群落中涉及粘着斑、黏合连接、紧密连接等方面的变化，免疫系统中涉及补体、白细胞经内皮迁移、趋化因子信号通路、造血细胞系等方面的变化，信号转导方面涉及cAMP 信号通路、AMPK 信号通路、FoxO 信号通路、TGF-β 信号通路、ras 信号通路、钙信号通路、cgmp-pkg 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路等方面的变化，表明电针可能通过调控某些基因的表达从而影响神经的传导及机体免疫功能的改变；结合KEGG 富集分析结果，基于电针治疗周围神经损伤研究现状筛选了可能与研究方向相关的8 个通路：白细胞跨内皮迁移通路、γ-氨基丁酸能突触通路、胆碱能突触通路、5-羟色胺突触通路、钙信号通路、紧密连接通路、粘着斑通路、肌动蛋白细胞骨架的调控通路。

综上所述，电针治疗周围神经损伤机制可能是通过改变细胞电位平衡、神经元轴突再生骨架结构的重建以及白细胞的迁移而改变周围神经损伤后修复与再生的微环境，然而具体的分子机制还需结合相关的差异基因及具体信号通路，进一步研究。