正交实验法优选酒洗红花的炮制工艺*

刘彩凤，梁 军，钟琳瑛，张 琦，田湾湾，刘冬涵，白 洁，杜守颖，何枢衡

（1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.亿帆医药股份有限公司，临安 311300）

红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花。夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干；性味辛温，归心、肝经，用于经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块，胸痹心痛[1]；其入药历史悠久，文献记载丰富，是中国的传统及临床常用药材，其炮制品酒红花在历史上也有沿用。最早东汉张仲景的《金匮要略》中记载红花为“红蓝花酒方”，将红蓝花与白酒一起放入锅中，煎减至半，红蓝花即红花[2]。明代《明医》里记载红花为酒洗红花[3]。清代吴仪洛所编写的《本草从新》记载红花为酒红花：“酒喷微焙”[4]。清代柴得华《妇科冰鉴》里“桃红四物汤”这一处方又沿用酒洗红花[5]。红花的酒制品各代不一，且酒洗红花的炮制方法无详细记载，在各版药典及地方炮制规范中也无收录，因此，酒洗红花的研究目前较欠缺。

酒洗这一炮制方法是历代所沿用的一种中药酒制法，一般认为药物经酒洗后，部分可渗入其组织内部，发挥缓性、增效等作用，大黄经酒洗后，可借酒之热，调和大黄之寒[6]，地黄经酒洗后，防治寒凉伤胃气[3]，也有部分药物经酒洗后可治妇人血气走作疼痛、月水不调及破血通经，如当归、红花，但是对红花来说，目前并没有文献对其酒炮制品的药效和成分进行研究。酒洗最早见于汉代张仲景《伤寒论》大黄“去皮，清酒洗”，用于调胃承气汤中，并且认为“酒洗入阳明经”[7]，后来酒洗炮制方法一直沿用，如从唐代、宋代、元代、明代及清代均出现酒洗当归，且现行《上海市中药炮制规范》记载当归酒洗方法为“取当归，喷洒黄酒，拌匀，使之吸尽，晒或低温干燥”。因此，综合地方炮制当归的酒洗方法及《本草从新》中酒红花的炮制方法，作为酒洗红花的炮制依据，文章就对酒洗红花炮制工艺、其酒洗前后含量差异和水煎液指纹图谱进行了一些实验研究，以期对关于酒洗红花研究提供一些科学借鉴。

1 仪器与试药

Thermo Fisher U3000 高效液相色谱仪[DAD 检测器，CM 7.2 色谱工作站，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；屹立QE-200 高速万能粉碎机；BSA 224S 电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；JM-B10002 电子天平（余姚市及纪铭称重校验设备有限公司）；BT 125D 电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；HH-6 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA，批号11637-201810，购自中国食品药品检定研究院）；山奈素（批号110861-201611，购自中国食品药品检定研究院）；水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇为色谱纯（美国Thermo Fisher Scientific 公司），其余试剂均为分析纯；黄酒（塔牌绍兴花雕酒，浙江省粮油食品进出口股份有限公司）。

红花购于北京鹤延龄药业发展有限公司。

2 方法与结果

2.1 指标成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 HSYA：色谱柱Shim-pack GIST C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0．02%磷酸（5∶20∶75）；检测波长403 nm；流速1 mL/min 柱温：30 ℃；进样体积10 μL。

山奈素：Shim-pack GIST C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0．1%磷酸（65∶35）；检测波长367 nm；流速1 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备方法 HSYA：精密称取HSYA 对照品适量，加25%甲醇制成质量浓度为0．626 g/L 的对照品母液。见图1。

图1 供试品和HSYA 对照品高效液相色谱（HPLC）图

图2 供试品和山奈素对照品高效液相色谱（HPLC）图

山奈素：精密称取山奈素对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0．545 g/L 的对照品母液。见图2。

2.1.3 供试品溶液的制备方法 HSYA：取红花粉末（过3 号筛）约0．4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率50 kHZ）40 min，放冷，再称定质量，用25%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

山奈素：取红花粉末（过3 号筛）约0．5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25 mL 称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液（15—37）5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

HSYA：精密吸取HSYA 对照品母液适量，将母液逐级稀释为0．250，0．125，0．063，0．031，0．006 g/L的对照品溶液，进样10 μL，测定。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=0．519 8X+1．726 7，R2=0．999 6；结果表明，HSYA 在0．006～0．626 g/L 范围内线性关系良好。

山奈素：精密吸取山奈素对照品母液适量，将母液逐级稀释为0．218，0．109，0．054，0．027，0．005 g/L对照品溶液，进样10 μL，测定。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=0．719 1X+1．242 6，R2=0．999 9；结果表明，山奈素在0．005～0．545 g/L 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液，连续进6 次，进样10 μL，测定对照品溶液中的峰面积值，HSYA 的RSD=0．23%，山奈素RSD=0．32%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 测定，根据峰面积计算HSYA RSD=0．56%，山奈素RSD=1．53%，结果表明供试品溶液中HSYA 和山奈素在24 h 内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批样品6 份，按照“2．1．3”项下方法制得6 份供试品溶液，进样10 μL，记录峰面积，计算含量，HSYA 的RSD=0．32%，山奈素RSD=1．88%，表明这两种方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取同一批样品6 份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按照“2．1．3”项下方法操作得到加样供试品溶液，按上述条件测定，HSYA 方法的平均回收率为97．70%，RSD=0．67%，结果见表1。山奈素方法的平均回收率为97．14%，RSD=2．29%，结果见表2。

3 正交设计优选酒洗红花炮制工艺

3.1 因素水平设计和酒洗方法 本实验以HSYA、山奈素为考察指标，采用正交实验设计法对影响红花酒洗工艺的加酒量、浸吸时间、烘干温度3 因素进行考察，选用了L9（34）正交表安排实验，因素与水平表见表3。

酒洗方法：取净红花，加黄酒喷匀后，浸吸一定时间，以相应的温度烘干至干燥为度。

表1 HSYA 加样回收实验结果

表2 山奈素加样回收实验结果

3.2 样品测定及结果分析 样品测定：精密吸取1～9 号供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定HSYA、山奈素的含量，以HSYA 和山奈素的综合评分为评价指标。综合评分[8]=（HSYA 含量/最高含量）×60+（山奈素/最高含量）×40。结果见表4 和表5。

结果分析：由直观分析可知，各因素对酒洗红花炮制工艺的影响顺序为A＞C＞B，方差分析结果发现因素A、C 有显著性差异，B 无显著性差异，其中A1＞A2＞A3，C3＞C2＞C1，综合直观分析及方差分析，选取酒洗红花炮制工艺A1B1C1和A1B1C3，即加酒量为50%，浸吸时间30 min，烘干温度40 ℃和加酒量为50%，浸吸时间30min，烘干温度80 ℃进行验证，A1B1C1与A1B1C3中HSYA 和山奈素的含量见表6。

对A1B1C1和A1B1C3中HSYA、山奈素的含量进行统计分析，HSYA P＞0．05，山奈素P＞0．05，表明HSYA 和山奈素在上述两种工艺条件下，并无显著性差异。依据药典对药材炮制的规定及节约节能的前提下，选取酒洗红花最佳炮制工艺为A1B1C1，即加酒量为50%，浸吸时间30 min，烘干温度40 ℃。

表4 正交实验结果（n=2）

表5 综合评分的方差分析表

表6 验证实验（n=2）%

4 红花酒洗前后的比较研究

4.1 红花酒洗前后的含量比较 将3 批红花按照最优酒洗工艺进行炮制，按“2．1．3”项下供试品溶液方法制备供试品溶液，并分别按“2．1．1”项下色谱条件测定，计算含量，结果见表7。

由上表可知酒洗后，炮制品HSYA 与山奈素的含量较生品稍有偏低，但差异不大。

4.2 红花酒洗前后指纹图谱比较

4.2.1 色谱条件 色谱柱：InertSustainSwiftTMC185 μm（4．6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-0．1%磷酸溶液；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：1．0 mL/min；进样量：15 μL。

4.2.2 供试品溶液制备 分别取红花生品和炮制品4 g，依照《医疗机构中药煎药室管理规范》煎煮，分两次煎煮，第1 次加水350 mL 煎煮45 min，第2 次加水300 mL 煎煮35 min，用300 目尼龙纱网布过滤，合并两次滤液，定容至500 mL，吸取适量水煎液离心（10 000 r/min，10 min），取上清液，过0．45 μm滤膜，即得。

4.2.3 指纹图谱比较结果 对比红花酒洗前后的HPLC 指纹图谱，见图3。结果显示，炮制后指纹图谱中特征峰数目并无明显变化。为了更直观比较酒洗前后各成分含量的变化，筛选出峰面积≥2 的17 个峰，以5 号HSYA 峰为参照，取其峰面积为1，计算红花炮制前后共有峰的相对峰面积，并将其以柱形图的形式表示，结果见图4。由图看出，在230 nm 的波长下，1～6 号峰在酒洗前后峰面积变化不大；7 号峰在酒洗后峰面积反而明显增加，8～17 号峰在酒洗后峰面积下降，其中以11、13、15 和16 号峰降低明显。

5 讨论

图3 红花酒洗前后水煎液指纹图谱

图4 生品和制品共有峰相对色谱峰面积比较

表7 3 批不同产地红花药材炮制品含量测定结果 %

酒洗红花系古文献记载的一种炮制方法，且酒制法在中药炮制中为一种常用方法。红花中含有黄酮类化合物、挥发油、红花多糖、脂肪酸等化学成分，其中红色素和黄色素是查尔酮类化合物，是红花中含有的最主要的化学成分之一，具有改善心肌供血、扩张血管、抗凝血和抗血栓等功效[9-11]。本实验遵循于此，按照酒洗炮制方法，筛选出红花的最佳酒洗工艺为辅料黄酒50%，浸吸时间30min，烘干温度40℃，其中温度符合2015 版《中国药典》对于药材炮制烘干温度的规定。

红花在上述最佳条件酒洗之后，进行多批次含量测定研究，结果显示，HSYA 和山奈素含量较生品低，但含量差异均不大。查阅文献得知[12-17]，这种变化可能与两种成分的热稳定性有关，HSYA 是热不稳定性性成分，遇热易分解，山奈素热不稳定性相对HSYA 较好，但在40℃的烘干温度下，两者的变化均不明显。同时，对红花的生品和炮制品进行水煎液指纹图谱比较研究，其水煎液的制备依照《医疗机构中药煎药室管理规范》煎煮，该工艺经前期摸索，煎煮参数稳定可行，且由于水煎液体积大，即使在煎煮中有微小误差，不足以对其水煎液成分的含量产生影响，同时，通过多波长筛选，在230 nm下，红花水煎液的指纹图谱整体峰多、响应值高，尤其小极性成分的响应值整体高于其它波长下，因此，基于此对其进行比较研究，发现红花在酒洗之后，大部分色谱峰峰面积有不同程度的降低，以小极性成分较明显，可能在酒洗的过程中，小极性成分更易溶解在酒中，造成含量损失。虽然红花经酒洗后成分发生变化，但对其药效问题，如可治疗妇人月水不调等，还需进一步深入研究。药效的物质基础是成分，对于指标性成分而言，酒洗炮制后HSYA 和山奈素的含量略有不同程度的降低，这两种成分是药典对红花的指控指标，酒洗炮制后，药效是否有改变还需药理实验验证，应根据药效结果合理的选择酒洗炮制品的指标，从而证明酒洗红花临床应用的合理性。