清热利湿外治法对宫颈癌荷瘤裸鼠抗肿瘤作用与MARK 信号通路的关系*

温利娟，薛晓鸥，米 鑫，谢 伟

（1．北京市顺义区妇幼保健院，北京 101300；2．北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中排名第三，且85%以上新发及死亡病例出现在发展中国家，中国是世界上宫颈癌高发国家，患病和死亡人数占全世界1/4[1]。目前，宫颈癌常用的西医治疗方法为手术治疗和放疗，辅助方法有化疗[2]。在宫颈癌治疗中，中医药治疗尚不能替代手术、放疗及化疗等治疗方法。但是在手术、放疗、化疗过程中，根据患者个体差异，采用望、闻、问、切四诊合参，辨证论治后用内服外用的中医治疗方法以扶正祛邪，能够稳定瘤体，有利于术后患者恢复，提升患者自身免疫力，提高生活质量，延长生存期，减轻患者在放化疗过程中的毒副作用，以利于治疗的顺利进行，有减毒增效之优势[3]。中医学中并无宫颈癌病名，根据其临床表现，归属于中医“癥瘕病”、“崩漏”、“带下”等病范畴。中医学认为本病的主要病机是正气虚弱，邪毒客于子门，瘀结胞中。“清热利湿外治法”前期临床及实验研究已经表明：能改善阴道局部免疫微环境，上调HLA-I 和CD8 分子的表达而增强机体对病毒免疫杀伤功能而起到抑制HR-HPV 作用[4-9]。

ERK 及P38 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，ERK 家族有5 个亚族，包括ERK1-ERK5。其中ERK1 及ERK2 通路中的两个重要成员之一；主要参与并调节了细胞的生长、发育、分化、分裂及死亡等多种生理过程，并且在细胞的恶性转化中起着重要的作用。ERK 及P38 在肿瘤发生发展和防治中起着重要的作用，是目前肿瘤研究的重要热点。

本实验研究清热利湿法体外抗肿瘤作用及机制，测量肿瘤体积及体质量，计算抑瘤率，HE 染色法观察肿瘤的形态学变化，并运用免疫组化方法，检测瘤体中p-ERK 及p-p38 蛋白表达水平，研究清热利湿外治法对宫颈癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用，进一步揭示其抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级BALB/c（nu/nu）裸小鼠35 只，雌性，5～6 周龄，体质量SPF 级BALB/cnu/nu，购于维通利华实验动物中心。饲养条件：SPF 级BALB/c（nu/nu）裸小鼠均由实验动物中心SPF 屏障系统的洁净层流架内，医学实验动物使用许可证编号：SCXK（京）2012-0001。实验室相对湿度为50%～70%，动物室温为（24±2）℃，采用12 h 昼夜间断照明，水料自由饮用。

1.2 受试药物 外用中药方由百川飞虹技术有限公司生产，注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司，Anti-Human Papillomavirus 16（E7）antibody、Anti-ERK1+ERK2 antibody、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG、Anti-Human Papillomavirus 16（E6）+18（E6）antibody、Anti-Rb antibody、Anti-P53 antibody均购自abcam，免疫组化试剂盒购自北京中衫生物科技有限公司。

1.3 宫颈癌细胞株 宫颈癌Siha 细胞株，购自上海复祥生物科技有限公司。

1.4 主要仪器 细胞培养箱（Thermo 公司）；酶标仪（Thermo 公司）；倒置显微镜（Nikon）；生物洁净使用超净台（Opti MAIR）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；游标卡尺（SYNTEK）；高精度电子称重天平（Ei）。

2 方法

2.1 宫颈癌Siha 细胞悬液制备 宫颈癌Siha 细胞株复苏后行细胞培养。培养条件是含10%胎牛血清、100mg/mL 链霉素和100 IU/m 青霉素的DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。取对数生长期细胞，用2．5%胰酶消化，离心，弃上清。培养基悬浮沉淀细胞，计数后调整细胞浓度2×107/mL。

2.2 动物与分组 35 只裸小鼠随机分为清热利湿外治法高剂量组、中剂量、低剂量、顺铂组、空白对照组。裸鼠购买后，预先在室内常规饲养，观察3 天。每只裸鼠用0．5 mL 注射器将0．2 mL 浓度为2×107/mL 的细胞悬液在无菌条件下皮下注射于裸鼠右前肢腋窝处皮下。在无特定病原体（SPF）环境饲养裸鼠，并观察裸鼠生长状态及肿瘤生长情况，以皮下结节直径＞0．5 cm 为成瘤标准。裸鼠成瘤后，将裸鼠称重，用随机数字表法分成5 组，每组7 只，进行给药。

2.3 各组给药方法 ①外用中药方高剂量组：0．942 8mg/kg；②中剂量组：0．471 4mg/kg；③低剂量组：0．235 7 g/kg；④顺铂组：浓度为5mg/kg，用量为0．5 mL，腹腔内注射，每4 天1 次；⑤空白对照组：不用药物观察。清热利湿外治法各组均使用无菌棉签将药物涂抹在裸鼠瘤体表面，每日一次。各组用药和观察时间均为4 周。

2.4 观察指标 每日观察裸鼠精神状态、活动力、反应、饮食、排便情况、皮下种植区外观及触感，每日用药前测量裸鼠瘤体的长径（a）和短径（b），测量裸鼠体质量。治疗过程中死亡裸鼠，均行解剖以明确死因。停药24 小时后，用裸鼠颈椎脱臼法处死裸鼠，剥取瘤组织，并瘤组织称重、进行体积测量，计算抑瘤率。肿瘤体积（V）=ab2/2，抑瘤率=[（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）÷对照组平均瘤重]×100%。

2.5 HE 染色 1）二甲苯2 次去蜡处理，每次15 min。2）将切片进行清洗：100%乙醇5 min 共2 次，80%乙醇5 min 1 次，蒸馏水5 min 1 次。3）苏木精液染色5 min。4）流水冲洗5 min，1%盐酸乙醇30 sec，水洗30 sec，蒸馏水过洗5 次。5）0．5%伊红液染色3 min，蒸馏水稍洗30 sec，80%乙醇稍洗30 sec，95%乙醇1 min 2 次，无水乙醇3 min 2 次，二甲苯3 min 2 次。6）中性树胶封固。

2.6 免疫组化SP 法 第一天：将切片放入37 ℃烘培箱内30 min，取出后室温放置10 min；脱蜡：将切片放入纯二甲苯中脱蜡3 次，每次15 min；将切片放入100%酒精2 次，每次10 min；将切片放入90%酒精2 次，每次10 min；将切片放入80%酒精1 次，每次10 min；将切片放入70%酒精1 次，每次10 min；将切片放入蒸馏水中3 min；将切片放入PBS 中3 次，每次3 min；灭活：双氧水直接滴加，室温内放置10 min；PBS 洗3 次，每次3 min；热修复抗原：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液中，大火煮沸3 min；室温内静置2 h 直至完全冷却，PBS 洗3 次，每次3 min；滴加5%BSA 封闭液，室温放置20 min；滴加一抗，将切片放入湿盒中，4 ℃冷藏冰箱内过夜。第二天：将湿盒从冰箱内取出，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加二抗，室温放置20 min，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加SABC，室温放置20min，PBS 洗4 次，每次5 min；DAB 室温显色，蒸馏水洗涤中止反应，自来水冲洗30 min；⑤苏木素轻度复染，40～45 s，自来水流水冲洗30 min 中止反应；将切片放入70%酒精1 次10 min；80%酒精1 次10 min；将切片放入90%酒精2 次，每次10 min；将切片放入100%酒精2 次，每次10 min；封片：中性树胶封片，要求胶少，无气泡。

2.7 结果判定标准 免疫组化采用半定量法检测蛋白表达水平，是根据阳性细胞的比例和染色强度进行评分。阳性细胞比例：随机选择5 个高倍视野，计算其中的阳性细胞比例，然后评分，＜5%为0 分，5%～25%为1 分，25%-50%为2 分；50%～75%为3 分；＞75%为4 分。染色强度：无显色为0 分，浅黄色或黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。蛋白表达水平=阳性细胞比例×染色强度。光镜下p-ERK 和p-p38 蛋白阳性细胞均表现为细胞浆或细胞膜呈棕黄色，而细胞核不着色。

2.8 统计方法 用SPSS 19．0 统计软件包进行数据处理，瘤体生长曲线采用重复测量方差分析，实验数据以均数±标准差（）表示，不同组间比较采用One-way ANOVA 分析，取P＜0．05 作为显著性差异水平。

3 结果

3.1 裸鼠移植瘤的生长情况 雌性裸鼠接种Siha细胞后，2 d 种植区皮肤呈白色改变，3～4 d 白色皮肤改变消失，5～6 d 种植区皮下可触及2～3 mm 瘤样结节，质地韧，7～8 d 种植区皮下可触及直径5 mm瘤样结节，质地稍硬。本实验35 只裸鼠成瘤率为100%。按裸鼠肿瘤体积大小随机分5 组，每组7 只，治疗前各组裸鼠平均体重无明显统计学差异（P＞0．05）。

图1 成瘤裸鼠

3.2 荷瘤裸鼠治疗前后体质量的变化 顺铂组裸鼠在用药后一周均出现活动量减少，厌食水，消瘦，皮肤干涩，其中2 只裸鼠分别在用药第17、18 天死亡，死亡裸鼠解剖其肝、肺、肾脏后未见明显异常，考虑为死亡为化疗后毒副作用所致。其余各组一般状况良好，未见药物不良反应。经过4 周治疗后，各组裸鼠平均体重：清热利湿外治法高剂量组（18．83±0．76）g，清热利湿外治法中剂量组（18．45±0．65）g，清热利湿外治法低剂量组（18．72±0．82）g，顺铂组（13．51±0．31）g，对照组（19．26±0．82）g，顺铂组与其余各组相比，裸鼠体质量明显下降（P＜0．05），清热利湿外治法3 个剂量组与空白对照组体质量无明显变化（P＞0．05），见表1。

3.3 各处理组裸鼠肿瘤体积变化 接种宫颈癌Siha 细胞后各组肿瘤体积均逐渐增大，对照组肿瘤体积增长较快，各治疗组移植瘤体积均小于对照组，其中清热利湿外治法高、中剂量组及顺铂组与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0．05）。清热利湿外治法低剂量组肿瘤体积与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05），见表1。

3.4 各治疗组裸鼠瘤重及肿瘤生长抑制率的比较 顺铂组肿瘤生长抑制率为75．82 3%，清热利湿外治法低、中、高剂量组抑制裸鼠Siha 皮下移植瘤的抑制率分别为14．94%、31．24%、36．23%，见表1。在治疗终点，顺铂组及紫柏凝胶高、中剂量组瘤重与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．05），而清热利湿外治法低剂量组瘤重与对照组比较无统计学意义（P＞0．05），见表1。

表1 各组裸鼠质量、瘤体积、瘤重、抑制率变化（）

表1 各组裸鼠质量、瘤体积、瘤重、抑制率变化（）

组别 裸鼠质量（g）瘤体积（cm3）瘤重（g）抑制率（%）外治法高剂量组 18．83±0．76 1．918±0．82# 1．727 5±0．63# 36．23外治法中剂量组 18．45±0．65 1．935±0．83# 1．813 1±0．74# 31．24外治法低剂量组 18．72±0．82 2．280±0．85 2．304 2±0．81 14．94顺铂组13．51±0．31 1．040±0．41# 0．655 0±0．14# 75．82空白对照组19．26±0．82 2．640±0．95 2．709 0±0．63

3.5 裸鼠移植瘤组织的病理学观察 肉眼观察各组裸鼠移植瘤组织呈结节状，肿瘤组织血供明显、丰富，组织切面呈鱼肉样，可见局灶性坏死，以顺铂组及外用中药方高剂量治疗组明显。镜下见各组肿瘤细胞呈圆形或卵圆形，肿瘤细胞核大且清晰，可见病理性核分裂，肿瘤细胞呈漩涡、簇团状生长，瘤团间可见坏死病灶形成，呈均质红染色样，细胞变大，细胞核染色加深，见核固缩、溶解、碎裂。各治疗组的肿瘤组织坏死区域均有增大，其中顺铂组坏死区域增大较为明显。外用中药方用药组随着治疗剂量的增高，肿瘤组织坏死区域呈逐渐增大趋势。

3.6 清热利湿外治法对p-ERK 蛋白表达的影响 从表2 可见，各用药治疗组与空白对照组相比较，p-ERK 蛋白表达水平均有不同程度下降，其中外用中药方高剂量组、中剂量组及顺铂组与空白对照组相比较具有统计学差异（P＜0．05）。提示外用中药方有下调p-ERK 蛋白表达的作用。

3.7 清热利湿外治法对p-p38 蛋白表达的影响 从表2 可见，各用药治疗组与空白对照组相比较，p-p38 蛋白表达水平均有不同程度下降，其中外用中药方高剂量组、中剂量组及顺铂组与空白对照组相比较具有统计学差异（P＜0.05）。提示外用中药方有下调p-p38 蛋白表达的作用。

图2 各组裸鼠大体情况

图3 各组裸鼠移植瘤组织病理学观察（×200）

图4 各组裸鼠移植瘤组织p-ERK 蛋白表达情况（×200）

图5 各组裸鼠移植瘤组织p-p38 蛋白表达情况（×200）

表2 清热利湿外治法对p-ERK、p-p38 蛋白表达的影响

4 讨论

清热利湿外治法全方由紫草、金银花、苦参、黄柏、百部、莪术、白芨等药物组成，以上中药采用水提、醇提法提取后，加用卡波姆等基质制作而成，全方具有清热祛湿、解毒活血、敛疮生肌、杀虫止痒之功效。该方由东直门医院名老中医郭志强教授创立，该方经过前期部分临床观察，用于治疗宫颈高危型HPV 感染，疗效甚佳。前期清热利湿体外实验研究结果亦证实此法能抑制宫颈癌Siha 细胞的增殖和诱导其凋亡[10]。

本实验通过对人宫颈Siha 细胞癌的动物研究，发现清热利湿外治法降低了人宫颈Siha 细胞肿瘤的生长。我们通过建立人宫颈癌Siha 细胞裸小鼠移植瘤模型，研究高、中、低剂量的清热利湿外治法治疗肿瘤效果，实验中采用模型组作为阴性对照，以细胞毒性药物顺铂作为阳性对照比较，结果显示清热利湿外治法对宫颈癌荷瘤裸鼠移植瘤生长有抑制作用。高、中、低浓度组的清热利湿外治法的肿瘤抑制率分别为36.23%、31.24%、14.94%，抑瘤效果呈剂量依赖性，随之外治法治疗剂量的增加，抑瘤效果增强。治疗期间荷瘤裸鼠无进食水量减少、消瘦、行动迟缓等副反应表现，显示外治方药物安全性高并无毒副作用。HE 染色病理检查发现，随着外治方治疗剂量增加，瘤团间的坏死灶比例增大。本研究结果显示，外治法对宫颈癌裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用。

ERK 及P38 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员，参与并调节了细胞的生长、发育、分化、分裂及死亡等多种生理过程，并且在细胞的恶性转化中起着重要的作用。目前，ERK 及P38 是肿瘤发展和防治研究的重要热点。实验结果表明，清热利湿外治法在一定剂量范围内可以下调p-ERK 及p-P38 蛋白表达水平，说明清热利湿外治法可以通过下调ERK/P38 MAPK 信号通路引起细胞周期阻滞进而阻滞宫颈癌细胞增殖，且清热利湿外治法对ERK/P38 MAPK 信号通路的调节点应该在上游，具体调节点还需进一步实验证实。