复合功能微生物在酱香型白酒生产中的应用研究

刘 宇，管桂坤，万自然，夏培禹，杜如冰，吴 群

（1.山东兰陵美酒股份有限公司，山东临沂 277731；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122）

酱香型白酒具有“酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、空杯留香持久”的特点，深受广大消费者的青睐[1-2]。独特的风味与其复杂的生产工艺密不可分，而酱香大曲的质量则是酱香型白酒风格特点的关键所在。目前，中国的经济处于高质量发展阶段，消费者对白酒品质的要求越来越高。研究表明，微生物的种类及数量对酱香型白酒的风味及质量有非常重要的贡献。因此，如何利用微生物强化酱香大曲，特别是一些对酱香酒品质起重要贡献的功能微生物，具有十分重要的意义。

本研究通过添加3株细菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌）和2株霉菌（宛氏拟青霉、米曲霉）强化酱香大曲，并将强化大曲应用于酱香酒的生产中，以期增强酱香型白酒的典型性。通过功能微生物强化酱香大曲与应用试验表明，添加适宜的微生物可以提升酱香型白酒的感官质量，这对北派酱酒的高质量发展具有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

菌种：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、宛氏拟青霉、米曲霉等，均由江南大学提供。

培养基：肉汤培养基（细菌用）；PDA培养基（霉菌用）；麸皮培养基（水分50%）。

仪器设备：YXQ-LS-75SN立式压力蒸汽灭菌锅；JHT-系列净化工作台；MJX-280S智能霉菌培养箱；FLY-211C恒温震荡培养箱；安捷伦7890A气相色谱仪；安捷伦气相色谱质谱联用仪GC 6890NMS 5975。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的扩大培养

获得功能微生物的纯培养→挑取1环单菌落→种子液培养（试管）→一级扩大培养（250 mL三角瓶，10%接种量）→二级扩大培养（3000 mL三角瓶，10%接种量）→强化应用

1.2.2 霉菌的扩大培养

获得功能微生物的纯培养→挑取3～5环单菌落→500 mL三角瓶（麸皮培养基）→培养2 d→转移至浅盘（麸皮培养基）→0.9%生理盐水浸出液→强化应用

1.2.3 大曲的检测方法

制曲打量水中加入功能微生物菌液混匀后开始压曲，每天定时测定大曲品温，并选取0 d、4 d、8 d、16 d、21 d、60 d时间段对试验曲水分和糖化力进行跟踪检测，按照QBT 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》重点检测60 d大曲水分、糖化力、液化力、发酵力和酯化力等指标，并结合大曲鉴评结果进行分析。另外，大曲的质量鉴评参照公司《酱香大曲技术要求及质量鉴定标准》进行评分。

1.2.4 酒醅的检测方法

强化曲投产后，每天定时测定酒醅发酵温度，对试验窖池选取0 d、5 d、10 d、20 d、26 d时间点进行动态跟踪测定，测定项目主要包括水分、酸度、淀粉和还原糖等常规指标，方法参照DB34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》进行。

1.2.5 原酒的检测方法

首先，统计试验窖池的出酒率，出酒率＝出酒量/投料量×100 %，其中投料量按3300 kg计算，出酒量统一折算成65%vol的出酒量，最后计算试验窖池的平均出酒率。其次，醇酸酯物质的检测，主要分析杂醇油、总挥发酸、总酯、酸酯比等指标。最后，原酒的感官质量品评，参照公司品评标准，邀请包括国家级评委在内的专业品评团队对所取酒样进行系统品评，评分标准参照T/CBJ 003－2016《固态法酱香型白酒原酒》，略有调整。

1.2.6 其他检测方法

挥发性物质检测，乙醇含量测定等参照王鹏方法[3]。

2 结果与分析

2.1 细菌的强化试验

2.1.1 大曲中的理化因素变化

添加不同剂量的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进行压曲（表1），为了解制曲过程中大曲的理化因素变化情况，对酱香大曲的制作过程进行了跟踪检测，结果如图1和图2所示。对照组与强化组之间温度、糖化力和水分变化趋势基本一致。品温的整体变化趋势为：大曲入房后在第2天即迅速升温，升温幅度高达20 ℃；随着微生物的生长和代谢活动的持续，在第8天第一次翻曲时仍然维持在49～53 ℃；翻曲过后品温稍有回落，第10天继续攀升，第14天品温涨至58 ℃左右；温度保持一段时间后，第15天以后品温逐渐回落，直至接近环境温度。

表1 强化试验芽孢杆菌在鲜曲中的理论数量

图1 制曲过程中大曲品温变化

由图2可知，大曲初始糖化力较高，随着品温的上升，一直下降至第16天，随后由于品温的降低糖化力稍有回升；21 d后随着水分的降低糖化力逐渐降至60～130 mg/g·h。

表2 强化试验酱香大曲质量鉴定评分结果

图2 制曲过程中糖化力和水分变化

2.1.2 大曲的质量鉴定

吡嗪类物质是重要的呈香呈味物质，也是白酒的健康因子，有助于突出酱香型白酒的风格特征[2，4]。颜林春等[5]从酱香大曲中筛选到10株功能芽孢杆菌，纯培养后强化酱香大曲发现，大曲中所含的2,3,5,6-四甲基吡嗪含量明显高于普通大曲。张荣等[6]从高温大曲中分离得到了3株产酱香香气的地衣芽孢杆菌，混合发酵6 d，有悦人的酱香香气，并从发酵液中检测到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭尔。霍颖玙等[7]从茅台镇酱香大曲中分离得到2株地衣芽孢杆菌，强化酱香麦曲，麦曲中吡嗪类含量高达32.8%，其中四甲基吡嗪含量为31.11%。

根据表2可知，强化曲的感官指标稍高于常规曲，主要表现为酱香气较浓郁；综合大曲的感官和理化指标初步判定1DB稍好。结合酱香大曲中HS-SPME-GC-MS挥发性组分检测结果可以发现，1DB中吡嗪类物质分别是1CK和1GB的1.26倍和2.01倍（表3）。总的来说，1DB的强化效果较好，有待于接下来的酿酒试验进一步地验证。

2.1.3 酒醅的理化指标

表3 强化试验酱香大曲中吡嗪类物质 (mg/g)

高温发酵为产生酱香物质提供了良好的条件，不仅是生成酱香物质的必要条件，同时也是生成乙醇的必要条件[8]。高温有利于嗜热芽孢杆菌的生长代谢，从而促进了酱香物质的大量生成。根据图3可知，1DB组发酵温度明显高于其他两组，这更有利于酱香物质的生成，初步判定1DB组强化效果较好。与1GB组相比，1DB组乙醇增加速率稍大，但低于对照组；另外，1DB组的出酒率也稍高于1GB试验组（图4）。选取比较典型的第四轮次酱香酒醅检测理化指标（表4），结果表明，各试验组的水分、酸度、淀粉和还原糖这4项指标变化相对合理正常，满足我公司酱香型白酒生产工艺要求。

2.1.4 原酒中的醇酸酯量比关系分析

从表5可以看出，强化组酱香酒中杂醇油比对照组高10.46%，总酯比对照组高2.81%；与1GB组相比，1DB组杂醇油较低、总酯较高、总挥发酸较高、酸酯比较高，通过这些指标可以初步判定1DB强化效果更好一些。

2.1.5 原酒的感官品评

根据表6和图5可知，1DB组品评得分最高，酱香、空杯留香、细腻度、醇厚度、净爽度、焦糊味、个性和典型性等8项指标整体都较好。相反，1GB组除酱香、焦糊感和个性这3个指标较突出外，其他指标相对较差，空杯留香最差。因此，以1DB组芽孢杆菌添加剂量为出发点，继续优化酱香大曲的强化工艺。

表4 强化试验第四轮次酱香酒醅理化指标

图3 发酵过程中酒醅温度变化

图4 乙醇含量变化及出酒率

表5 强化试验第四轮次酱香酒中酸醇酯量比关系

表6 强化试验第四轮次酱香酒质量品评

图5 强化试验第四轮次酱香酒品评轮廓图

2.2 细菌与霉菌组合的强化试验

考虑到细菌强化试验部分强化大曲曲质较松散、糖化力偏低等，结合细菌强化试验结果设计如表7所示的酱香大曲强化与应用试验[9]。

2.2.1 大曲中的理化因素变化

大曲入房后第2天品温迅速升至51～56 ℃（图6），曲坯变软，颜色变深，同时散发出醇香和酸香。伴随着各种生化反应，在第8天时（第一次翻曲）品温仍然维持在52～58 ℃，可闻到较浓郁的酱香香气。翻曲过后，品温继续攀升，在第11～15 d顶温出现（最高约60 ℃），并维持一段时间（5～7 d）。第二次翻曲（16 d）之后，由于环境温度和大曲水分的降低，品温逐渐下落。第三次翻曲（25 d）后，品温变化较小，酱香较纯正。30 d以后水分低至17%，品温随着曲房温度同步变化，直至接近环境温度。

表7 组合强化试验功能微生物生物量在鲜曲中的控制标准 (cfu/g)

图6 制曲过程中大曲品温变化

根据图7可以发现，大曲起始糖化力较高，随着品温的上升一直下降至第8天，随后糖化力稍有回升；16 d后糖化力逐渐降至50～90 mg/g·h。

2.2.2 大曲的质量鉴定

根据表8可知，2GG和2DD综合得分高于对照组2CK，2DG和2GD则低于对照组。因此，相对协调的功能微生物比例关系所制作的强化曲质量要好于比例关系失调的。结合酱香大曲中HSSPME-GC-MS挥发性组分检测结果可以发现，2GG和2DD中吡嗪类物质分别是1CK的1.27倍和1.23倍（表9）。另外，通过添加霉菌强化液，曲质得到明显改善，仅个别曲较松散。总的来说，2GG和2DD的强化效果较好，有待于接下来的酿酒试验进一步地验证。

图7 制曲过程中糖化力和水分变化

2.2.3 酿酒过程中的理化因素变化

根据图8可知，强化组发酵温度明显高于对照组，这更有利于酱香物质的生成；其中，2DG与2DD两组在入池发酵3～10 d酒醅温度较高（34～35 ℃），初步判定其强化效果较好。由图9可发现，各试验组乙醇含量变化情况相差不大；另外，2GG组出酒率与对照组相近，其他强化组出酒率均低于对照组。选取比较典型的第四轮次酱香酒醅检测理化指标（表10），结果表明，各试验组的水分、酸度、淀粉和还原糖这4项指标变化相对合理正常，满足我公司酱香型白酒生产工艺要求。

表8 组合强化试验酱香大曲质量鉴定评分结果

表9 组合强化试验酱香大曲中吡嗪类物质 (mg/g)

表10 组合强化试验第四轮次酱香酒醅理化指标

图8 发酵过程中酒醅温度变化

2.2.4 原酒中的醇酸酯量比关系分析

根据表11可以看出，强化组酱香酒中杂醇油比对照组高21.27 %～31.75 %，总酯比对照组高13.65%～31.54%；总体而言，2GG组杂醇油居中、总酯较高、总挥发酸居中、酸酯比偏低，通过这些指标可以初步判定2GG强化效果更好一些。

图9 乙醇含量变化及出酒率

表11 组合强化试验第四轮次酱香酒中酸醇酯量比关系

2.2.5 原酒的感官质量品评

根据表12和图10可知，2GG组和2DG组品评的酱香、空杯留香、细腻度、醇厚度、净爽度、焦糊感、个性和典型性等8项指标整体都较好，其中2GG组的酱香、醇厚度、典型性和空杯留香最突出；而2GD组和2DD组这8项指标均较差，2CK对照组居中。因此，高浓度的霉菌强化液更有利于提升酱香酒的感官质量，细菌强化液的浓度还可以适当调低。

表12 组合强化试验第四轮次酱香酒质量品评

图10 组合强化试验第四轮次酱香酒品评轮廓图

2.3 对比性分析

通过HS-SPME-GC-MS技术对比性分析2CK、2GG和2DG 3组酱香酒中的挥发性物质，并应用Morpheus在线软件作热图分析（图11），结果表明，2GG组大多数微量成分含量明显高于2CK组与2DG组；2DG组大多数微量成分含量低于2CK；与2CK和2DG组相比，2GG组绝大多数呈香呈味的酯类、醇类、吡嗪类（2,5-二甲基-3-丁基吡嗪等）等物质含量得到明显提升。结合2.2的分析最终判定：2GG组强化效果最好。

3 结论

通过3年酱香大曲强化与应用试验，初步优化了功能微生物的添加种类与剂量组合，即每1 g鲜曲中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、宛氏拟青霉和米曲霉的生物量分别为8.7×104、5.8×104、7.5×104、2.0×105和2.0×103cfu，性能较优。利用此工艺制作出的强化大曲，酱香香气较浓郁，将其应用于酱香酒的生产后，酒体的酱香、空杯留香、细腻度、典型性等指标都得到了明显改善，大大提升了公司酱香酒的质量水平。

本试验仅从酱香酒的品评角度出发，优化酱香大曲的强化工艺，并通过基本的理化指标来辅助判定强化效果，还未涉及到微生物变化和发酵规律解析，有待于进一步的研究。

图11 第四轮酱香酒微量成分热图比较