不同青稞品种与高粱中结合态风味成分和萜烯类物质的对比研究

车富红，冯声宝，李善文，黄和强，吴 群，陈 双，王宇乔

（1.青海互助青稞酒股份有限公司，青海互助 810500；2.江南大学，江苏无锡 214122）

青稞酒是以青稞为原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的中国传统蒸馏酒。青稞酒被沈怡方先生高度评价为“高原明珠、酒林奇葩”。青稞酒中特有的粮香味主要来源于青稞原料，酿酒粮食对酒的风格有着不可或缺的作用，一是粮食中的成分（如淀粉）糖化后在微生物作用下发酵生成乙醇的同时会产生许多香味成分；二是粮食中的蛋白质、脂肪等成分在发酵过程中会分解成小分子化合物，成为酒体风味成分的前驱物（如氨基酸）或者本身就是风味成分；三是粮食本身带来的风味成分，包括游离态和结合态风味成分[1]。粮食中游离态风味成分大部分为相对分子质量较低、沸点低、挥发性较强的化合物，高温加工过程易造成挥发损失[2]。粮食中结合态风味成分本身是无风味的风味前体物质（通常是糖苷类化合物），在酸和碱的作用下释放出来成为挥发性风味成分。原料中的风味化合物主要以结合态、不挥发性的、无气味的风味前体物质存在并积累于植物中[3]。结合态风味化合物在植物原料中的含量为游离态风味化合物的2～5倍[4]。酿造粮食的结合态风味成分可能是影响白酒风格的潜在因素，在制曲、发酵和蒸馏等过程中，风味前体物质会分解、释放出来[5]。曾有报道基于酸水解法研究了6种白酒酿造原料（高粱、大麦、糯米、玉米、大米、小麦）的结合态风味成分，一共检出35种结合态风味化合物[6-7]。朱伟岸等[6]通过固相萃取和HS-SPME-GC-MS技术在高粱中检出35种结合态风味化合物，其中包括4种醇类、10种醛酮类、4种芳香族、6种萜类、6种酸类、3种酯类和2种杂环类化合物。但目前对青稞原料中结合态风味物质的研究还未有报道。本研究采用全二维气相色谱-飞行时间质谱技术（GC×GC-TOFMS）对不同青稞品种以及粳高粱中的结合态风味物质进行对比分析，对进一步解析以青稞为酿造原料的青稞酒风味独特性具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：黑老鸦青稞（产地：青海）、瓦蓝青稞（产地：青海）、白浪散青稞（产地：青海），以上青稞品种均由青海互助青稞酒股份有限公司提供；粳高粱（产地：山东）江南大学提供。

试剂：氯化钠、氯化钙（分析纯）；甲醇、乙醇、乙醚、正戊烷（色谱纯）；超纯水（实验室用水均为煮沸并冷却至室温的超纯水）；盐酸、氢氧化钠（分析纯）；L-薄荷醇（内标）。

仪器设备：全二维气相色谱-飞行时间质谱仪（GC×GC-TOFMS，配备Pegasus 4D工作站），美国LECCO公司；系统：GC×GC系统由安捷伦7890N气相色谱和冷喷调制器KT-2001组成，本实验采用液氮冷喷调制器；自动进样器MPS2德国Gerstel公司；LC-C18固相萃取柱（2 g，10 mL），上海安谱试验科技股份有限公司；Supelco固相萃取装置（Visiprep DLSPG），美国Supelco公司，旋蒸仪、氮吹仪购于上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器条件

全二维气相色谱-飞行时间质谱条件进样口解析温度250 ℃，解析时间5 min，进样口温度230 ℃；柱温箱升温程序：一维柱温箱初始温度40 ℃，保持0.5 min，以3 ℃/min升温至70 ℃，再以5 ℃/min升温至230 ℃，保持25 min；二维柱温箱初始温度45 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min升温至150 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升温至200 ℃，最后以10 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min；柱系统：采用60 m×0.25 mm ID×0.25 μm DB-FFAP为一维柱，1.5 m ×0.18 mm ID×0.2 μm Rxi-17为二维柱，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接；调制器补偿温度：10 ℃；调制器设置：调至周期6 s（冷喷2 s，热喷1 s），冷却剂为液氮，热调制气体为压缩空气，冷调制气体为氮气；质谱条件：质谱检测器为飞行时间质谱，EI离子源温度200 ℃，电离电压：-70 V，传输线温度250 ℃，采用全扫描方式。

1.2.2 青稞原料中结合态风味前体物质的提取和分离

取15 g粉碎的青稞原料（过26目筛）于250 mL三角瓶中，加入75 mL色谱纯乙醇，放置12 h，4 ℃冰浴超声萃取30 min。离心（4 ℃，10000 r/min，15 min）取上清液。用75 mL色谱纯甲醇按上述同样的方法进行处理，最后将两次处理的上清液进行合并，于40 ℃下旋转蒸发去除有机溶剂，加入20 mL煮沸处理的超纯水重新溶解，得前体溶液A。

1.2.3 青稞原料中结合态风味前体物质的纯化

将前体溶液A用5 mL色谱纯乙醚/戊烷（1∶1，v/v）萃取3次，以去除其中的游离态风味物质。采用固相萃取柱（SPE）法将得到的前体溶液进一步分离纯化，加入20 mL煮沸处理的超纯水重新溶解后，得到前体溶液B。

1.2.4 青稞原料中结合态风味物质的酸碱热处理

用1 mol/L的稀盐酸调节前体溶液B至pH1.0，沸水浴30 min，立即冷却后再用1 mol/L的稀氢氧化钠调节pH7.0，采用固相萃取柱（SPE）法将得到的前体溶液C进行自动进样。

1.2.5 数据分析

所得数据经Pegasus 4D的工作站自动处理，定性所用的图谱库为NIST/EPA/NIH Version 2.0，所得数据再经进一步处理得到最终结果。定量方法采用内标法，进行半定量分析。

2 结果与分析

2.1 不同青稞品种与粳高粱中结合态风味成分的对比分析

全二维气相色谱技术（GC×GC）是近年开发出的一种多维色谱分离技术，该技术将两种分离机理不同的毛细管色谱柱通过一个调制器实现串联结合形成二维气相色谱系统对样品进行分析。分析样品通过第一维色谱柱分离后连续转移至第二维色谱柱中进行再次分离。与常规一维气相色谱比较，它具有分辨率高，灵敏度高，峰容量大等优点[8]。全二维气相色谱与高灵敏度的飞行时间质谱（TOFMS）联合使用，是实现复杂样品挥发性组分分离鉴定的有力工具。目前GC×GC-TOFMS技术已经被用于多种酒精饮料挥发性组分的分析，是当前分析酒精饮料中挥发性组分最高效的技术手段[9-10]。本研究采用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC-MSTOFMS）检测原料中的结合态风味物质，将匹配度高且相似度大于700的化合物进行归类整理，最终确定瓦蓝青稞中含有344种物质，白浪散青稞中含有403种物质，黑老鸦青稞中含有352种物质，粳高粱中含有282种物质。而采用同样的前处理方式，运用GC-MS对青稞中结合态风味物质进行分析，发现白浪散青稞中最终只鉴定出结合态风味物质127种、黑老鸦青稞中鉴定出126种、瓦蓝青稞中鉴定出118种、粳高粱中鉴定出81种，远少于采用GC×GC-TOFMS技术所鉴定出的风味成分种类数量。

通过将这些物质按照结构细分为13类，即醛类、醇类、酮类、酯类、呋喃类、萜烯类、芳香族类、酸类、苯酚类、吡嗪类、吡啶类、内酯类以及其他类。比较发现不同品种青稞中风味物质总含量差异显著（图1），风味物质总含量比较结果为白浪散青稞（355927.1 μg/kg）＞黑老鸦青稞（276753.9 μg/kg）＞粳高粱（123286.5 μg/kg）＞瓦蓝青稞（116406.7 μg/kg）。

图1 原料中风味物质总含量比较图

从图1可以看出，白浪散青稞和黑老鸦青稞中的醛类物质含量显著高于粳高粱和瓦蓝青稞（p≤0.05）。醛类物质在4种原料中含量最高，其次是醇类、酮类。李春扬等[11]研究表明，醛类化合物在4种原料中所占比例最大。本研究发现白浪散青稞中醛类含量最高，4种原料中含量最高的醛类主要有(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、戊醛、庚醛、4-甲氧基-苯甲醛、壬醛、2,4-二甲基苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、(反式)-4-壬烯醛、(Z)-6-壬烯醛、辛-2-烯醛、反-2-,顺-6-壬二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、乙醛、糠醛、2-甲基-2-丁烯醛、正己醛、巴豆醛；其中，正己醛在四种原料中含量最高，在3种不同品种青稞中均达到了25%以上，粳高粱中达到了63%，主要原因是青稞中风味成分丰富，醛类所占比重比较小，粳高粱中风味成分较少，所以醛类物质所占比重较大。醛类化合物具有强烈的香味，阈值较低，脂肪族低级醛有刺激性气味，并随碳链长度增加而增强，在C8—C12时香味强度达到最高值，随着碳链增长，香味强度急剧下降，醛类的香味一般似果香，味甜带涩[12]。

研究发现，醇类物质在黑老鸦青稞中的含量最高，主要有三甘醇、（E）3-辛烯-2-醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-醇等，在黑老鸦青稞中占51%左右，瓦蓝青稞中占31 %左右，白浪散青稞中占19 %左右，粳高粱中占25%左右。我们同时发现1-辛烯-3-醇在黑老鸦青稞原酒和瓦蓝青稞原酒中含量比较高，白浪散青稞酒中次之，与原料中的含量趋势一致。

酮类物质在白浪散青稞中含量最高，主要有2-庚酮、仲辛酮、1-戊烯-3-酮、3-辛烯-2-酮、2-丁酮等，在黑老鸦青稞中占35%左右，瓦蓝青稞中占31%左右，白浪散青稞中占42%左右，粳高粱中占33%左右。原料中酯类非常少，其中辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯含量比较高，在青稞原酒中的含量也较高。

青稞原料中呋喃类化合物2-乙基呋喃含量最高、2-戊基呋喃（具有豆香、果香类似蔬菜香气）次之。青稞原料中呋喃类化合物主要有2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃、2-正丁基呋喃、2-甲基呋喃等，占呋喃类的70%左右，张晓磊等[12]研究表明，青稞中2-戊基呋喃最高，此数据与本研究结果有差异，可能与青稞的品种差异相关。

2.2 不同青稞品种及粳高粱中结合态风味成分的占比分析（表1）

表1 不同青稞原料中风味化合物占比 (%)

对4种原料中的风味成分进行占比分析，从表1可以看出，瓦蓝青稞、白浪散青稞、黑老鸦青稞中醛类占总量的26 %～28 %、醇类占总量的12 %～18%、酮类占总量的12%～13%，而粳高粱中醛类物质占总量的44%，醇类占9%，酮类占11%，与青稞的风味成分占比有非常大的差异性，主要原因是青稞中微量成分种类比粳高粱中更多、更复杂。

本实验室开展的天佑德青稞酒（主要以白浪散青稞和黑老鸦青稞为酿造原料）与部分以粳高粱为原料酿造的典型清香型白酒微量成分进行比较分析发现，天佑德青稞酒中的己醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛含量明显高于以高粱为原料酿造的部分典型清香型白酒中的含量（数据未发表），青稞原料在前处理过程中也具有较明显的醛类物质所具有的青草香，说明青稞酒中某些含量较高的醛类风味成分可能由青稞原料带入。有文献报道黄酒中的醛类物质以及部分受氧化作用影响的化合物会随着黄酒的氧化而增加，这也与黄酒的陈香感有很大的相关性[13]，原料中的醛类物质是风味成分形成的前驱物，经过后期的发酵作用会生成更多的风味成分。

青稞原料中含有丰富的氨基酸，青稞原料在发酵过程中，通过氨基酸分解脱氨产生的杂醇油如正丁醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇基本上都呈苦味，其中正丁醇、正丙醇的苦味较重，异丁醇极苦，异戊醇则是微带甜苦[14]，适量的高级醇是青稞酒香味的主要组成成分，但当含量过高时，会给酒体带来苦涩味。

酮类物质是白酒中的香味物质和助香物质，在白酒中的含量约占香味组分的2 %～3 %，虽然含量较少，其作用却不可忽视。酿酒原料中的不饱和酮在发酵过程中会发生一系列反应，生成白酒中重要的香气成分。但过于追求酮类物质也是不可取的，因其具有特殊气味，过量会使酒质粗糙，口感不佳，香气不协调。

研究还发现吡嗪类物质中2-甲基吡嗪，2,3,4,5-四甲基吡嗪在原料中含量最高，约为吡嗪类的90%。在酒醅研究中发现，四甲基吡嗪含量在发酵0 d、5 d时含量较高，随着发酵时间的延长，四甲基吡嗪含量呈降低趋势。在制曲过程中随着培养时间延长四甲基吡嗪含量呈增长趋势。

因青稞原料风味成分及营养成分比例存在差异，因此在青稞原酒口感方面也有一定的差异，如我们发现黑老鸦青稞酿造的原酒粮香突出；瓦蓝青稞酿造的原酒具有水果香与花香；白浪散青稞酿造的原酒清香纯正。

2.3 不同品种青稞与高粱中萜烯类物质的对比分析（表2）

白酒中的萜烯类化合物具有呈香或呈味作用，而原料中萜烯类物质也具有一定呈香呈味作用，除了单萜和少量的倍半萜具有气味外，大部分萜烯类物质还呈现一定的苦味[15],另外，萜烯类物质一般都有一定的功能活性作用，如香芹酚的抗菌活性比麝香草酚要高[16]，肉桂醛可以抑制很多微生物生长，如细菌、霉菌[17]，α-蒎烯和柠檬烯在DPPH（1,1-二苯-2-三硝基苯肼）试验时，具有较低的抗氧化活性，萜品烯和萜品油烯则显示出较高的供氢能力，以对抗DPPH自由基[18]。因此，萜烯类物质一直是白酒中的热门研究对象。

如图2所示，萜烯类物质在黑老鸦青稞中检出38种，相对含量23.9 mg/kg；白浪散青稞中检出41种，相对含量21.1 mg/kg；瓦蓝青稞中检出39种，相对含量10.3 mg/kg；粳高粱中只检出20种，相对含量55.8 mg/kg。青稞原料与粳高粱相比较，青稞中萜烯类物质种类更多、相对含量也更高。青稞入口具有一定的微苦味，很有可能是萜烯类物质含量较为丰富导致的。但青稞中的萜烯类物质含量高，种类丰富，也说明青稞相比高粱很可能具有更为优良的功能活性，这在很多科学研究中均得到佐证[19-21]。

分析发现，4种原料中都含有alpha-大马酮，在黑老鸦青稞中含量最高，青稞中都含有反式芳樟醇氧化物（呋喃型），而粳高粱中未检测到。黑老鸦青稞中二氢月桂烯醇、alpha-大马酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、alpha-柏木烯、BETA-水芹烯、vitispirane等比其他3种原料相对含量都高。白浪散青稞中萜烯类物质相对含量也比瓦蓝青稞、粳高粱高，如桉叶油醇、4-萜烯醇、α-松油醇、伞花烃、1,4-桉叶素、GAMMA-萜品烯（松油烯）等。瓦蓝青稞中萜烯类物质总含量较低，粳高粱中萜烯类物质总含量最低。

研究还发现，香叶醇、（+）斯帕托烯醇、反式-4-檀香醇等是粳高粱中独有的。而BETA-二氢紫罗兰酮、beta-紫罗酮、橙花醇氧化物、反式芳樟醇化物（呋喃型）、桉叶油醇、1,4-桉叶素、杜松烯、BETA-水芹烯、萜品油烯、GAMMA-萜品烯、花侧柏烯等萜烯类物质是青稞原料中所特有。

图2 原料中萜烯类物质总含量比较图

表2 4种原料中萜烯类物质分析结果 （μg/kg）

通过全二维分析检测不同品种青稞酿造的天佑德青稞原酒，发现黑老鸦青稞原酒中含有46种萜烯类物质，瓦蓝青稞原酒中含有44种萜烯类物质，白浪散青稞原酒中含有39种萜烯类物质。

3 结论

用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GCTOFMS）检测原料中的结合态风味物质，最终确定瓦蓝青稞中含有344种物质，白浪散青稞中含有403种物质，黑老鸦青稞中含有352种物质，粳高粱中含有282种物质。青稞中的结合态风味物质及其相对含量均高于粳高粱，其中1-辛烯-3-醇在青稞原料中相对含量均高于粳高粱，同时发现其在黑老鸦青稞原酒和瓦蓝青稞原酒中含量较高、白浪散青稞原酒中次之。辛酸乙酯在青稞原酒中也比较高，同时在青稞原料中相对含量也比较高。不同酿酒原料中萜烯类物质含量也有一定的差异，黑老鸦青稞含有38种萜烯类物质，白浪散青稞含有41种，瓦蓝青稞含有39种，而粳高粱仅含有20种萜烯类物质。萜烯类物质既具有呈香或呈味作用，也具有一定的活性功能，不同品种的青稞中萜烯类物质含量更为丰富，这与文献报道所揭示的青稞这一青藏高原地区独特原料所具有的健康功能是一致。黑老鸦青稞原料中含有更为丰富的萜烯类物质如二氢月桂烯醇、alpha-大马酮、4-氧代异佛尔酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、alpha-柏木烯、BETA-水芹烯、vitispirane等；其中，香茅醛、BETA-二氢紫罗兰酮、beta-紫罗酮、玫瑰氧化物、橙花醇氧化物、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、桉叶油醇、1,4-桉叶素、杜松烯、BETA-水芹烯、萜品油烯、GAMMA-萜品烯、花侧柏烯等萜烯类物质在3种青稞中都能检测到，是青稞原料中独有的；而香叶醇、香橙烯氧化物、（+）斯帕托烯醇、反式-4-檀香醇等是在粳高粱中独有的。本研究首次阐明了不同青稞品种中的风味成分以及萜烯类物质的组成，发现了青稞相比高粱的独特风味成分和萜烯类活性成分优势，对揭示青稞与以青稞为原料酿造青稞酒的风味和健康相关性具有重要的参考意义。