酿造环境中细菌的筛选及代谢产物研究

张龙云，蒲 春，高 涛

(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800)

白酒是以富含淀粉质的粮谷类为原料，以酒曲为糖化发酵剂，主要采用固态发酵，经蒸馏、贮存和勾调而成的含酒精的饮料[1]。白酒生产在中国具有悠久的历史，一直深受人们的喜爱，且因原料种类和配比、酒曲种类和生产工艺以及自然环境等因素的不同，形成了不同特色不同香型的白酒[2]。结合白酒的生产工艺可以看出，微生物参与淀粉糖化、酒精发酵、产酯生香等生化过程，对于白酒风格的形成起到至关重要的作用[3]。白酒的生产是开放式多菌种共同发酵[4]，酿造环境对开放式的生产模式具有很重要的影响，尤其是空气环境，整个白酒生产过程均与空气接触，而空气中存在大量微生物孢子，空气为酿酒微生物迁移运动提供了媒介，为白酒生产提供了大量不同种类的细菌、霉菌和酵母菌等。细菌在酿酒微生物群落中扮演重要角色，主要参与形成白酒复杂的风味和香气[5]，尤其是对白酒中乳酸、乙酸、丁酸、己酸及其对应的乙酯以及α-联酮化合物的生成有重大贡献。本试验从洋河酒厂酿造环境中筛选优势细菌进行分离培养，通过形态学和生理生化方法进行初步分类鉴定，并对单株菌发酵培养后的代谢产物进行顶空气相色谱分析，根据其发酵特性将其应用到芝麻香型白酒大曲生产中。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 研究对象

以洋河酒厂的2个一区酿酒车间和2个二区酿酒车间的酿造环境为研究对象，主要是场区酿酒车间窖池周围空气、工作环境空气以及大曲、酒醅、窖泥、黄水、操作工具等。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、无机盐、氢氧化钠、氯化钠等均购于国药集团，为分析纯；麸皮，市售；生化鉴定管购于青岛海博生物技术有限公司。

仪器：PHS-3E台式pH计，LDZH-200KBS立式灭菌锅，DNP-9162A电热恒温培养箱，岛津气质联用仪，HW-150C温控振荡培养箱，90-3恒温双向磁力搅拌器，SPME手动萃取装置，Agilent GCMS/7890A-5975C联用仪。

1.1.3 培养基

基础培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌20 min。固体培养基加2%琼脂。

麸皮固体培养基：麸皮100 g，加水70 mL，搅拌均匀后，121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 空气采样

采样方法为自然沉降法,分别在窖池周围与工作环境选定5个采样点，每个点做3个平行，将平皿暴露于空气中5 min。采样后37 ℃培养24 h，观察记录细菌的种类和数量。采用中华人民共和国国家标准确定的公共场所每立方米空气中微生物总数的计算公式[6]计算空气中细菌的浓度。

公式为：E=1000×50 N/At

式中：E为单位体积内空气细菌数（cfu/m3）；

A为培养皿的面积(cm2)；

t为培养皿暴露时间(min)；

N为培养皿中细菌菌落数。

1.2.2 生产工具采样

用无菌棉签蘸取无菌水来回擦拭工具表面，放入取样袋带回。在实验室无菌操作，将棉签放入装有约2 mL无菌水的小试管，振荡使样品溶于水中，取200 μL样品溶液平板涂布。在37 ℃培养箱中培养24 h，观察记录细菌的种类和数量。

1.2.3 固形物及液体采样

称10 g样品溶于90 mL无菌水的三角瓶中，120 r/min振荡摇匀30 min，再用试管依次梯度稀释后涂布平板，在37 ℃培养箱中培养24 h，观察记录细菌的种群和数量。

1.2.4 产香细菌的筛选

将斜面保存的细菌分别接种到装液量300 mL和500 mL三角瓶肉汤培养基，置于37 ℃摇床培养24 h后，以10 %接种量接种于麸皮固态培养基1000 mL三角瓶中37 ℃固态培养6 d，以感官评定的方法对产香细菌进行初筛，重点筛选能产生酱香的细菌。

1.2.5 生理生化试验

生理生化试验原理和方法参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[7-8]。

1.2.6 顶空固相萃取条件

称取0.5 g样品，5 mL饱和氯化钠于顶空瓶中。将顶空瓶置于50 ℃水浴中恒温10 min（将水浴杯置于磁力搅拌器上），插入75 μm CAR/PDMS on PDMS萃取纤维头顶空吸附30 min，于250 ℃解吸5 min后进行GC-MS分离鉴定。

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm，0.25 μm)；载气为He，流速1 mL/min；程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温速率升至80 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃/min保持7 min；汽化室温度250 ℃；不分流[9]。

2 结果与分析

2.1 场区空气细菌的分布特征

以洋河酒厂的2个一区酿酒车间和2个二区酿酒车间的酿造环境空气为研究对象，利用自然沉降法采集场区酿酒车间窖池周围空气和工作环境空气样本，进行细菌适温培养，并对细菌进行种类和菌体浓度统计。由图1可知，一区环境空气中细菌的菌体浓度明显多于二区环境空气中细菌的菌体浓度，工作场所环境空气中细菌的菌体浓度明显多于窖池环境空气中细菌的菌体浓度，其中一区窖池环境空气中细菌菌体浓度是二区窖池环境空气中细菌菌体浓度的1.75倍，一区工作场所环境空气中细菌菌体浓度是二区工作场所环境空气中细菌菌体浓度的2.26倍，这是因为空气中的细菌是白酒酿造微生物的重要来源之一,老产区窖池因发酵生产时间长，富集的细菌较多，因而窖池中细菌与周围环境空气迁移的较为频繁，使老产区窖池环境空气的细菌菌体浓度明显高于二区窖池环境空气中的细菌菌体浓度，同时工作场所是酒醅加曲前处理的场所，曲中细菌浓度远远超过空气中细菌浓度，与空气细菌进行交互，会提高空气中细菌菌体浓度，且一区生产酿造时间更长，工人的操作使得空气流动更快，最终结果是空气中富集的细菌也更多，所以一区工作场所环境空气中细菌菌体浓度显著超过二区工作场所环境空气中细菌浓度，工作场所环境空气中细菌菌体浓度显著高于窖池环境空气中的细菌菌体浓度。由图2可知，一区环境空气中细菌种类比二区环境空气中的细菌种类多，工作场所环境空气中细菌种类比窖池环境空气中的细菌种类多。主要原因是一区生产使用时间长，经过长时间的驯化和适应，更加利于细菌生长，使环境空气中拥有更多的细菌种类；工作场所环境空气比窖池环境空气相对更开放，同时由于生产操作，它的流动性也更强，所以能富集更多种的细菌。白酒的生产是开放式多菌种共同发酵，与空气接触较多，空气微生物会对发酵产生重要影响，空气微生物数量和种类越丰富对白酒发酵生产越有利，从场区空气细菌种类和菌体浓度上来看，一区微生物组成与结构更加丰富和稳定。环境中共提取到29株细菌，优势菌菌落形态如图3，从显微镜镜检的结果表明，环境空气中芽孢杆菌占大多数。

2.2 产香风味细菌的筛选

在麸皮固体培养基上接种细菌种子液，37 ℃培养6 d，每天进行一次感官评定并记录。随着培养进行，陆续筛选出10株能在麸皮固体培养物产生酱香味较为明显的细菌，以此作为下一步复筛的出发菌株。

图1 不同功能区空气细菌浓度分布特征

图2 不同功能区空气细菌种类分布特征

2.3 产香风味细菌的培养特征

菌株在基础培养基上菌落特征见表1。其中，1#、7#和10#菌落形态相似，菌苔厚，呈乳脂状；3#、6#和9#菌落形态相似，菌苔薄，略透明；2#、4#、5#和8#菌落形态相似，菌落边缘呈丝毛状不整齐，产生淡红色色素。

显微观察菌株的细胞形态特征见表2。这10株菌都是芽孢杆菌，按菌体宽度大致可分为3个标准，图4分别是具有代表性的1#、6#、10#细菌。

菌株的生理生化特征见表3。经16s rRNA鉴定，1#菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌株为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；3#菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenifor-mis）；4#菌株为多粘类芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌株为环状芽孢杆菌（Bacillus circu-lans）。

图3 酿酒空气中优势菌落形态

表1 菌株的培养特征

表2 菌株的细胞形态特征

图4 1#、6#、10#细菌形态

表3 菌株的生理生化特征

2.4 细菌固态发酵产物分析

图5 代表菌株2#吡嗪类化合物气相色谱图

将10株细菌纯种液态培养后，气相色谱分析液态发酵产物。同时，接种于麸皮培养基中，利用顶空固相微萃取-气质连用方法，分析10株细菌固态发酵产物。

经过分析可知，10株细菌定性到的化合物数量和种类都较多，既有相同的风味物质，又有独特的风味化合物：10株细菌分别定性到20种、24种、27种、28种、28种、17种、27种、29种、38种、31种含量较多的风味化合物，其中9#菌产风味物数量最多；这些代谢风味化合物主要集中在吡嗪类化合物、芳香族化合物、醛类、酮类、多元醇、烯醇类、呋喃类化合物及其他杂环化合物等，还有少量的酸类、酯类、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物。其中吡嗪类化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，吡嗪类化合物蒸汽压低、易挥发，且香势强、香味阈值低，在食品中作为重要的风味物质。四甲基吡嗪是构成芝麻香和酱香风味的重要风味物质，可以为酒体提供充足的焙烤香气和焦香味；并且定性到吡嗪类化合物的前体2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在2#和7#菌株中定性到；3-羟基-2-丁酮/醋嗡在1#、3#、4#、6#、7#、8#、9# 7株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加口味绵、甜、柔软、细腻感[10]，3-羟基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠长后味，嗜热芽孢杆菌可以代谢这些物质形成吡嗪类化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈创木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈创木酚等含量较高。同时，运用内标法计算，进一步对几种典型风味物质含量进行定量分析，结果如表4、图6。

表4 功能性细菌典型风味化合物含量表

图6 典型风味物质色谱图

由表4可知，吡嗪类化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中产量相对丰富，四甲基吡嗪产量最高的是8#菌，达到了3.49（×10-10g/g），其次是5#菌3.08（×10-10g/g）其他菌种也检测到，但含量相对较低；β-苯乙醇只在4#、5#、8#和10#中，并且含量相差不大；酚类物质主要是愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚，愈创木酚产量最高的是2#菌4.51（×10-10g/g），其次是1#菌3.57（×10-10g/g），4-乙烯基愈创木酚产量最高的也是2#菌29.98（×10-10g/g）。β-苯乙醇具有浓郁的水果和蜂蜜的香气，能够赋予酒体自然发酵的香气，愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚则可以提供较多的坚果类香气，赋予酒体成熟的焦香、酱香，可以赋予调味酒较多的酱香感。

通过本研究，初步确定了10株菌种液态和固态发酵产物。其中，有些风味物质如吡嗪类、多酚类等是芝麻香和酱香风味的重要风味物质，为酒体提供充足的焙烤香气和焦香味，丰富了口感，为菌种进一步应用提供了参考。

3 结论

分析车间酿造环境中微生物，感官评定法筛选出10株产芝麻香细菌，形态学观察、生理生化试验、16s rDNA序列分析后，鉴定1#菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；3#菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；4#菌为多粘类芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌为环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）。通过气相色谱分析液态发酵产物和顶空固相微萃取-气质联用分析固态产物，发现这10株产芝麻香细菌，代谢产物主要为吡嗪类化合物、芳香族化合物、醛类、酮类、多元醇、烯醇类、呋喃类化合物及其他杂环化合物等，还有少量的酸类、酯类、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物，其中代谢产物中有很多与芝麻香风味形成有关的化合物和其前体物质，有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、β-苯乙醇、愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚。此外芽孢杆菌在高温制曲方面有很大的应用前景，在此基础上，今后将对菌株的耐热特性，产糖化酶、液化酶和蛋白水解酶活力，以及产特殊香味物质做进一步研究，以期应用于芝麻香高温大曲的研制。