一种酿酒酵母菌在白酒生产中的强化应用

何宏魁，李冬冬，刘国英，李晓欢，李 兰，曹润洁，李安军

（1.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州 236820；2.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽亳州 236820）

酿酒微生物在白酒生产过程中起着极其重要的作用，从大曲的生产到窖池发酵，都有酿酒微生物的参与，其中酵母菌作为主要的酿酒微生物之一存在于大曲中[1]，在白酒酿酒过程中起着至关重要的作用。随着现代生物工程技术的发展，功能性酵母菌逐渐被发现，如酿酒酵母(Saccharomyces)、假丝酵母(Candida)、接合酵母(Zygosaccaromyces)、伊萨酵母(Issatchonkia)、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和异常毕赤酵母（Pichia anomala）、柠檬形接合酵母(Zygosaccaromyces cidrci)、东方伊萨酵母(Issatchonkia orientalis)、毕赤酵母(Pich-ia burtonii)、汉逊酵母(Hanseniaspora)[2-6]等。这些酵母分别起着酿酒和生香的作用。

以从安徽古井贡酒桃花曲中分离出的1株酿酒酵母菌为研究对象，分析菌株生长代谢特征，探究在白酒发酵过程中添加强化此菌株对白酒生产带来的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌株：从古井桃花曲中分离出的1株酵母菌。

试剂：酵母菌基因组DNA提取试剂盒（天根）、Taq酶（生工）。

仪器设备：SX-70高压灭菌锅，IMH400-S生化培养箱、MaxQ 485HP振荡培养箱、PCR仪、WatersI-Class/Xevo TQD气相色谱-质谱联用仪（GCMS）、Agilent 6890A气相色谱。

1.2 试验用培养基

YPD培养基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸馏水1000 mL，pH5.0～5.5，115 ℃灭菌20 min。

液态发酵培养基：糖度为12 Bx的高粱糖化液。

固态培养基：新鲜干燥的麸皮、玉米粉。孟加拉红培养基（成品），121 ℃灭菌30 min。

1.3 试验方法

1.3.1 分子生物学鉴定

根据酵母菌分类学研究标准方法做分子鉴定。酵母核基因组的提取使用酵母基因组DNA提取试剂盒，按照说明书操作。

使用引物NL1和NL4进行26S rDNA D1/D2区的扩增。PCR反应体系（50 μL）：50 mg/L模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，dNTP 5 μL，buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，最后添加ddH2O定容50 μL。反应条件：94 ℃/3 min；94 ℃/1 min，55 ℃/1 min，72 ℃/1 min，30个循环；72 ℃/10 min。PCR产物北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI的Genbank数据库中进行比对。

1.3.2 酵母发酵的制备

将菌株接种到孟加拉红固体培养基上，28 ℃培养2～3 d活化；然后用接种环将活化后的菌株转接到20 mL YPD培养基的三角瓶中，于28 ℃120 r/min培养24 h；取酵母菌种子液接种到装有250 mL高粱发酵培养基的三角瓶中，装液量10 mL，在120 r/min，28 ℃条件下摇床培养72 h。

1.3.3 发酵代谢产物分析

（1）气相色谱分析条件

分流进样，分流比60∶1，进样口温度：230 ℃；升温程序：35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升温至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升温至195 ℃，保持18 min。

（2）气相质谱联用仪分析条件

进样不分流，流速0.9 mL/min；进样口温度：230 ℃；升温程序：35 ℃保持4 min；以2 ℃/min升温到60 ℃不保持，以6 ℃/min升温到180 ℃保持15 min。

1.3.4 酵母曲的制备及其理化分析

（1）酵母曲的制备

将试管中的酵母菌接种到装有250 mL的YPD液体培养基中，28 ℃、120 r/min摇床培养48 h。然后将培养好的种子液转接到3 L YPD液体培养基，28 ℃、120 r/min摇床培养48 h。最后转接到固态培养基（麸皮与水1∶1，高压灭菌处理），品温控制在30 ℃，培养36 h。

（2）酵母曲理化分析

菌落数测定：根据国家标准GB 4789.2—2010。

发酵力测定：参考企业标准QJ/GJ 08.01—2017。

1.3.5 酵母曲强化发酵酿酒试验

根据实际情况，制定酿酒试验方案，实验共20个窖池（实验组10个，对照组10个）。

实验一：实验组大米查一加1 kg酿酒酵母曲强化发酵；对照班组按照正常工艺操作，不添加酵母曲。

实验二：实验组大米查一、大米查二各加1 kg酿酒酵母曲强化发酵；对照班组按照正常工艺操作，不添加酵母曲。

2 结果与分析

2.1 发酵代谢产物分析

将酵母菌发酵液代谢的挥发性产物采用顶空气相色谱与质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术进行分析，其总离子流图谱如图1所示，代谢产物分析结果见表1。

图1 酵母液态发酵产物HS-SPME-GC-MS分析总离子流图

表1 酵母菌液态发酵产物HS-SPME-GC-MS分析结果

由表1可以看出，该酿酒菌株发酵产物中，主要代谢产物是乙醇，代谢比例占40.24%，是白酒的主体成分。其次代谢19.89 %的3-甲基丁醇和15.33%的苯乙醇。3-甲基丁醇和苯乙醇均是白酒中重要的风味成分。其中3-甲基丁醇具有果香，可以增加酒体的醇甜感，让酒体更丰满[7]；苯乙醇是米香型白酒的主体香味成分之一[8]。该酵母菌株还代谢出其他挥发性香味物质，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸等，这些香气成分，在白酒香气形成中扮演着重要角色。在浓香型白酒的主体香味成分中，辛酸乙酯的绝对含量并不高，但其香气强度贡献值比传统观点认为的四大酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大，仅次于己酸乙酯，呈现较强的果香味。

2.2 分子生物学鉴定结果

测序得到的26S rDNA基因序列，保留其可靠的587 bp序列进行系统发育分析。序列如下：

通过NCBI的BLAST比对，该菌株的序列与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列相似性为100%。

2.3 酵母曲理化分析

该酵母菌株制备的酵母曲，每1 g绝干功能曲中，酵母菌数量为8.1×108～11.6×108cfu。同时对酿酒功能曲进行发酵力检测，将其曲浸出液稀释1000倍后，发酵力依然为213.6 g/100 g·72 h。

2.4 酵母曲强化发酵酿酒试验

根据实验方案，对实验组和对照组窖池升温情况进行测量对比，结果如图2所示。

图2 酿酒实验组和对照组窖池温度变化

由图2可以看出，从窖池温度变化曲线来看，符合浓香型白酒发酵温度变化规律。实验组较对照组相比，实验组升温较快，顶温高出1～2 ℃，且中挺时间长2 d左右，到缓落时期，实验组温度下降相对较慢。

根据试验方案，对实验组和对照组对应窖池出酒率进行统计和分析，结果如图3所示。

图3 实验组与对照组出酒率、名酒率对比

由图3可以看出，实验一组与对照一组相比较，出酒率提高了1.67%，名酒率提高了0.89%；实验二组与对照二组相比较，出酒率提高了2.31 %，名酒率提高了0.62 %；实验二组与实验一组相比较，其出酒率较实验一略高，名酒率无差异。

对酒样进行气相分析，统计结果如图4所示。

图4 实验组与对照酒样成分含量

由图4可知，实验组的酒样中己酸乙酯、乙缩醛、己酸、总酸含量均高于对照组，而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于对照组，尤其是乳酸乙酯降低明显，两个实验组的乳酸乙酯分别降低了19.3 %、21.4 %；各组实验之间相比较，实验二总酯含量最高为832.5 mg/100 mL。

取本次实验混合酒样进行专业品评，结果如表2所示。

表2 酿酒实验混合酒样品评结果

由表2可知，添加优良酿酒酵母曲的实验方案一和方案二的酒样较对照组酒样，酒质更优，且实验方案二的酒样优于实验方案一酒样。

3 讨论

利用分子鉴定技术对古井桃花曲中1株酵母菌进行鉴定，该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces)。对其发酵代谢产物进行分析结果表明，该酵母菌发酵产生多种挥发性风味物质，本次共检测出49种挥发性风味物质，主要包括醇类、酯类、酚类、酸类等。其中醇类物质含有10种，相对含量高达76.51%，尤其是乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇，相对含量为75.46%。将酿酒酵母制备成曲后，发酵力明显强于大曲，并且具有一定的酯化力。将此酵母曲与大曲共同混合组配，用于酿酒生产，发现添加酿酒曲后，窖池的升温较快，并且顶温要比对照组高出1～2 ℃，且整个发酵过程中试验组的酒醅升温都略高于对照组。试验组的出酒率也高于对照组2 %左右。实验组的酒样中己酸乙酯、乙缩醛、己酸、总酸含量均高于对照组；乙缩醛是浓香型白酒老熟和质量的重要标志之一，也是有别于低档酒的指标之一[9]；而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于对照组，尤其是乳酸乙酯降低明显；各组实验之间相比较，实验二总酯含量最高。可见，添加了本株功能酿酒酵母菌株可以起到“增己降乳”的作用，使酒体酯类比例更协调，进一步提高了基酒的品质。