非对称轴向卟啉光敏剂的合成及其光动力学性质表征

王思宇，常晶晶，李艳辉，李艳伟，段潜，3

（1.长春理工大学 化学与环境工程学院，长春 130022；2.长春理工大学 材料科学与工程学院，长春 130022；3.教育部光电功能材料工程研究中心，长春 130022）

自癌症［1］被发现以来，它就成为了严重威胁人类健康的头号杀手之一。光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）［2-5］是上世纪80年代发展起来的治疗肿瘤的新方法，在治疗恶性方面区别肿瘤于手术、化疗、放疗等传统治疗手段［6-7］，具有选择性高、疗效确切［8］、微创及适应性好［9］、毒性低［10］、可姑息治疗和可保护容貌及重要器官等［11］优点。光动力疗法的作用机制［12-14］是利用光化学原理，将光敏剂药物注射到患者体内，使光敏剂能够在体内随着血液循环分布于肿瘤部位，在一定波长的激发光照射下，光敏剂药物因吸收大量光能从而被激发产生较高的能量，并将这些能量传递给肿瘤部位的氧使其变成活性较高的单线态氧及一些活泼的自由基，这些产物与生物大分子发生作用，破坏细胞和细胞器的结构与功能，从而杀伤肿瘤细胞，达到治疗癌症的目的。光动力学疗法在临床应用上所采用的光敏剂多为卟啉类化合物［15-16］，卟啉是一类具有大环共轭特殊结构和独特性能的化合物。我国最早在1983年就已经成功研制了第一代光敏剂—癌光啉［17-20］，这是世界上第一种被阐明了确切化学结构的卟啉类光敏剂。第一代光敏剂有红外区吸收系数低、对皮肤穿透性不好并伴有光敏反应和代谢慢等的缺点。因此在其后的研究中，以克服第一代光敏剂这些缺点为基础开发了包括5-氨基酮戊酸［21］、间-四羟基苯基二氢卟酚［22］、初卟啉锡［23］、亚甲基兰及亚甲苯兰［24］、苯卟啉衍生物［25］和内源性卟啉［26］等第二代光敏剂［27-31］。我国在第二代光敏剂的研究中也取得了长足进展，上海第二军医大学研制的血卟啉单甲醚［32］对肿瘤的杀伤效果与苯卟啉衍生物单环酸A［33］相类似，血卟啉单甲醚目前已成功用于治疗鲜红斑痣［34］且已经获批上市。但这类光敏剂也具有一定的缺点，如水溶性差、颜色深、易聚集而发生自猝灭从而使荧光和单态氧的产生同时减少、有一定的细胞毒性、靶向性低。另外，带有正电荷的卟啉分子在进入血液循环时，较容易被网状内皮系统吞噬，大大降低了肿瘤组织的分子数。本研究拟以卟啉为研究对象进行新型第三代光敏剂［35］的合成，制备化学结构明确、理化性质稳定、水溶液分散好、靶组织选择性高、毒副作用低的光敏剂。这种新型光敏剂的治愈率会超过传统的治疗方法，并更大程度减轻癌症患者的的痛苦。同时，这种高效且毒副作用低的抗癌药物，将具有广阔的应用前景和巨大的开发价值。

1 实验

1.1 仪器和试剂

电子天平、磁力搅拌器、电热真空干燥箱、磁力加热搅拌器、恒温水（油）浴锅、旋转蒸发仪、普通白光光源、自制特定波长LED光源设备、样品的紫外光谱是日本SHIMADZU公司UV-1240型紫外-可见分光光度计测得；红外光谱是日本SHIMADZU公司FTIR-8400s型傅里叶变换红外光谱仪测得；核磁1H-NMR谱是美国Varian公司JEOL JNMA400型核磁共振仪测得。

对羟基苯甲醛、聚乙二醇、苯甲醛、吡咯、丙酸、无水硫酸镁、无水乙醚、二氯甲烷、二甲基亚砜、甲醇、丙酮、二环己基碳二亚胺、石油醚、N，N-二甲基甲酰胺、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3，3′-二硫代二丙酸、透析袋、4-二甲氨基吡啶用于反应，从国药集团公司购买，其中吡咯在使用前为了除阻聚剂进行重新蒸馏，液体颜色由淡黄色变成无色透明状态为止，实验中提到的其它试剂均未经其它处理可直接使用。

1.2 单羟基苯基卟啉（TPP-OH）的合成

如图1所示，将80 mL丙酸加入到三口瓶中，接回流装置，加热使丙酸沸腾，加入3.05 g（25 mmol）对羟基苯甲醛和7.70 mL（75 mmol）苯甲醛，搅拌至溶解，然后用恒压滴定漏斗缓慢滴加6.80 mL（100 mmol）新蒸吡咯和20 mL丙酸的混合物，在10 min之内滴加完毕，在微沸下继续回流1小时，停止加热，冷却到80℃左右时，加入60 mL无水乙醇，冷却过夜，过滤得到紫色固体，用二氯甲烷作展开剂，收集层析柱色谱第二条色带。浓缩后用氯仿和石油醚重结晶，产物产率为31.3%。

图1 TPP-OH的合成路线

1.3 单羟基苯基卟啉接6-氯-1-己醇（TPPC6-OH）

如图2所示，将TPP-OH（0.63 g，1 mmol），6-氯-1-己醇（0.15 ml，1.15 mmol）和碳酸钾（0.14 g，1 mmol）放入250 ml的单口瓶中，加入100 ml的N，N-二甲基甲酰胺后充分混合，接回流冷凝装置后，将混合物保持在155℃下回流12 h后，停止反应，待反应物放冷至室温，移取反应液倒入盛有1 000 ml去离子水的烧杯中，静置过夜。将混合物抽滤后得到滤饼，将滤饼用二氯甲烷萃取，并用无水硫酸镁滤过除水干燥。真空箱过夜后收集粗产物，将粗产物在硅胶柱上纯化，二氯甲烷作洗脱液，收集第三条色带。产率36.2%。

图2 TPPC6-OH的合成路线

1.4 将TPPC6-OH配金属锡（SnTPPC6-OH）

如图3所示，将TPPC6-OH（0.2 g，0.3 mmol）、无水氯化亚锡（2.2 g，0.3×30 mmol）和50mL的N，N-二甲基甲酰胺加入到100 mL的两口圆底烧瓶中，磁力搅拌加热回流，待反应5 h后停止反应，磁力搅拌下将反应液冷却至室温，然后将滤液倒入含有1.0 L去离子水的烧杯中，静置，过滤后得到滤饼。用350 mL二氯甲烷将滤饼溶解后，用去离子水连续萃取三次，用无水硫酸镁固体除水干燥后，将液体转移至旋转蒸发瓶减压蒸干，真空干燥后得到紫色固体。

图3 SnTPPC6-OH的合成路线

1.5 二硫键改性的羧酸末端卟啉的合成（Sn-TP⁃PC6-S-S-COOH）

如图4所示，将SnTPPC6-OH（1.34 g，2 mmol）、3，3'-二硫代二丙酸（0.84 g，4.00 mmol）和4-二甲氨基吡啶（0.25 g，2.00 mmol），在氮气保护下溶于60 mL无水N，N-二甲基甲酰胺的密闭装置中，将密闭装置移入冰水浴中固定，待冷却至0℃，然后缓慢滴加入5 mL N，N-二甲基甲酰胺与二环己基碳二亚胺（0.82 g，4 mmol）的混合物，将溶液在室温下搅拌过夜。过滤混合物以除去二环己基脲，用饱和食盐水和二氯甲烷洗涤混合物，用无水硫酸钠干燥。通过蒸发除去二氯甲烷后，得到粗产物。将粗产物在硅胶柱上分离，产率为56.1%。

图4 SnTPPC6-S-S-COOH的合成路线

1.6 将SnTPPC6-S-S-COOH与PEG偶联形成（SnTPPC6-S-S-PEG）

如图5所示，以聚乙二醇（Mn=2 000）为偶联剂，经酯化反应合成两亲性的光敏剂SnTPPC6-S-S-PEG。将SnTPPC6-S-S-COOH（100 mg，0.023 mmol），1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（8.8 mg，0.046 mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（5.2 mg，0.046 mmol）溶于25.0ml二甲基亚砜中，在30℃下搅拌2.5 h以活化SnTPPC6-S-S-COOH的羧基，然后将聚乙二醇（4.6 mg，0.023 mmol）溶于5 mL二甲基亚砜后逐滴滴加到SnTPPC6-S-S-COOH的混合体系中，保持混合物在40℃反应72 h。所得溶液用去离子水透析3天（MWCO=2.5 kDa）。最后，对SnTPPC6-S-S-PEG的水溶液冷冻干燥，得到棕红色粉末。

图5 SnTPPC6-S-S-PEG的合成路线

2 结果与表征

2.1 TPP-OH的表征

图6为单羟基苯基卟啉的紫外-可见光谱图，单羟基苯基卟啉有两种类型的特征吸收带，分别是电子从基态So跃迁至第二激发单重态S2产生的一个B带和跃迁至第一激发单重态S1产生的四个较弱的Q带。在TPP-OH的紫外光谱图中，B带即Soret带，出现于413 nm处；Q带分别出现于515 nm，550 nm，592 nm，645 nm处。

图6 TPP-OH在CH2Cl2的紫外-可见光谱图

图7为TPP-OH红外吸收光谱中，其中3 432 cm-1处为较强的羟基伸缩振动峰，3320 cm-1和964 cm-1处分别为为吡咯环上N-H的伸缩振动和面内弯曲振动峰，在1 172 cm-1处是羰基C-O的伸缩振动峰，而 1 602 cm-1，1 512 cm-1，1 441 cm-1，1 348 cm-1，1 069 cm-1，801 cm-1，730 cm-1和703 cm-1处为单羟基苯基卟啉环的骨架伸缩振动峰。

图7 TPP-OH的红外光谱图

图8为单羟基苯基卟啉的核磁氢谱图，其中δ=8.84 ppm处为吡咯环上八个质子的化学位移，δ=8.22 ppm处为苯环上的邻位氢质子峰，δ=8.05 ppm处对应为羟基所在苯环的邻位质子峰，苯环上的间、对位质子峰出现在δ=7.76 ppm处，δ=7.23 ppm处为羟基所在苯环的间位氢质子峰，卟啉环内质子的化学位移约在δ=-2.79 ppm处，羟基上的质子峰出现在δ=5.29 ppm处。图中峰面积与对应氢的个数成正比，由此可以推判出己经合成产物的结构与单羟基苯基卟啉相符。

图8 TPP-OH的1H-NMR谱

2.2 TPPC6-OH的表征

图9是TPPC6-OH的紫外光谱图，单羟基苯基卟啉接6-氯-1-己醇有一个较强的B带和四个较弱的Q带。B带出现于413 nm处，Q带出现于515 nm，551 nm，590 nm，647 nm。

图9 TPPC6-OH在CH2Cl2的紫外-可见光谱图

图10是TPPC6-OH的红外光谱图，单羟基苯基卟啉接6-氯-1-己醇后在3 318 cm-1处出现较强的羟基伸缩振动峰，2 933 cm-1和966 cm-1处分别为吡咯环上N-H的伸缩振动和面内弯曲振动峰，在1 173 cm-1处是羰基C-O的伸缩振动峰，而1 605 cm-1，1 509 cm-1，1 438 cm-1，1 352 cm-1，1 475 cm-1，800 cm-1，728 m-1和700 cm-1处为单羟基苯基卟啉环的骨架伸缩振动峰。

在TPPC6-OH的1H-NMR谱图11中，δ=8.81 ppm处为吡咯环上八个质子的化学位移，δ=8.15 ppm处为苯环上的邻位质子峰，δ=8.04 ppm处对应为羟基所在苯环的邻位质子峰，苯环上的间、对位质子峰出现在δ=7.68 ppm处，δ=7.66 ppm处为羟基链所连接苯环的间位质子峰，羟基上的质子峰出现在δ=5.21 ppm处，羟基链上的质子峰分别出现在δ=4.16 ppm，δ=1.91 ppm，δ=1.57 ppm，δ=1.51 ppm，δ=1.20 ppm，卟啉环内质子的化学位移约在δ=-2.84 ppm处。图中峰面积与对应氢的个数成正比。因此可以判断出己经合成出了TPPC6-OH结构。

图10 TPPC6-OH的红外光谱图

图11 TPPC6-OH的1H-NMR谱图

2.3 SnTPPC6-OH的表征

图12为SnTPPC6-OH在DMF溶液中的紫外可见光谱图，可以清楚地看出在563 nm和605 nm处分别出现两个弱的连续吸收峰，可将其归属为Q带吸收；在429 nm处有一个强吸收峰，可将其归属为B带吸收。从其紫外光谱可看出：吸收峰最强的B带红移，且吸收峰的个数减少，是由于Sn4+配位到卟啉的空腔形成配合物后，由于其分子对称性提高产生的光谱学变化。

图12 SnTPPC6-OH在DMF中的紫外-可见光谱图

图13为SnTPPC6-OH的红外光谱图，3 428 cm-1处为较强的羟基伸缩振动峰3 057 cm-1和2 926 cm-1处的峰是卟啉环及吡咯环上C-H伸缩振动吸收峰，1 599 cm-1处的峰是C=C双键的伸缩振动峰，1 437 cm-1和1 475 cm-1处的峰是卟啉环及吡咯环骨架振动吸收峰，751 cm-1和702 cm-1处的峰是苯环上C-H弯曲振动峰。与图10中TPPC6-OH红外图谱比较可以看出，2 933 cm-1处卟吩环上N-H的特征吸收峰消失，表明金属锡成功配位到卟啉中心。

图13 SnTPPC6-OH的红外光谱图

图14为SnTPPC6-OH的1H-NMR谱图，其中δ=8.81 ppm处为吡咯环上八个质子的化学位移，δ=8.25 ppm处为苯环上的邻位质子峰，δ=8.13 ppm处对应为羟基所在苯环的邻位质子峰，苯环上的间、对位质子峰出现在δ=7.73 ppm处，δ=7.26 ppm处为羟基链所连接苯环的间位质子峰，羟基上的质子峰出现在δ=4.22 ppm处，羟基链上的质子峰分别出现在δ=3.62 ppm，δ=1.93 ppm，δ=1.60 ppm，δ=1.50 ppm，δ=1.19 ppm。图中峰面积与对应氢的个数成正比，卟啉环内质子峰δ=-2.84 ppm处消失，因此可以判断出己经合成出了SnTPPC6-OH结构。

图14 SnTPPC6-OH的1H-NMR谱图

2.4 SnTPPC6-S-S-COOH的表征

图15为SnTPPC6-S-S-COOH在DMF溶液中的紫外可见光谱图，可以清楚地看出在558 nm和599 nm处分别出现两个弱的连续的Q带吸收峰，在425 nm处有一个强B带吸收峰。与图12相比，图谱形状大体相似但B带和Q带均有一定程度的蓝移且Q带仍为两个较弱的吸收峰。

图15 SnTPP-S-S-COOH在DMF溶液中的紫外可见光谱图

图16为SnTPPC6-S-S-COOH的红外光谱图，1 745 cm-1为羧基的伸缩振动峰，1 728 cm-1是酯基的伸缩振动峰，3 022 cm-1和2 925 cm-1是卟啉环和吡咯环上C-H伸缩振动吸收峰，1 576 cm-1处的峰是C=C双键的伸缩振动峰，1 439 cm-1和1 472 cm-1分别是吡咯环及卟啉环骨架振动吸收峰，756 cm-1和703 cm-1是苯环上=C-H弯曲振动峰。

图16 SnTPP-S-S-COOH的红外光谱图

在SnTPPC6-S-S-COOH的核磁氢谱图17中，δ=9.124 ppm为吡咯环上8个氢的化学位移，δ=8.245处为苯环上的邻位质子峰，δ=8.148 ppm处对应为羟基所在苯环的邻位氢质子峰，苯环上的间、对位氢质子峰出现在δ=7.74 ppm处，δ=7.26 ppm处为羟基链所连接苯环的间位质子峰，羟基上的质子峰出现在δ=4.22 ppm处，羟基链上的质子峰分别出现δ=3.63 ppm，δ=2.88 ppm，δ=2.77 ppm，δ=2.14 ppm，δ=1.6 ppm处。

图17 SnTPP-S-S-COOH的1H-NMR谱图

2.5 SnTPPC6-S-S-PEG的表征

图18为SnTPPC6-S-S-PEG在DMF溶液中的紫外可见光谱图，可以清楚地看出在562 nm和603 nm处分别出现两个弱的连续的Q带吸收峰，在428 nm处有一个强B带吸收峰。与图15相比，图谱形状相似但B带和Q带均有一定的红移。

图18 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中的紫外可见光谱图

图19为SnTPPC6-S-S-PEG的红外光谱图，与图16相比，1 745 cm-1处羧基的伸缩振动峰消失，3 437 cm-1为末端-OH的伸缩振动峰；2 925 cm-1，2 848 cm-1和1 359 cm-1是卟啉环和吡咯环上C-H伸缩振动吸收峰；1 735 cm-1，1 243 cm-1，1 087 cm-1是酯基的伸缩振动峰；1 644 cm-1和1 456 cm-1是吡咯环及卟啉环骨架振动吸收峰，757 cm-1和799 cm-1是苯环上=C-H弯曲振动峰，说明SnTPPC6-SS-PEG已经合成。

图19 SnTPPC6-S-S-PEG的红外光谱图

图20为SnTPPC6-S-S-PEG的核磁氢谱图，其中δ=9.137 ppm为吡咯环上8个氢的化学位移，δ=8.240 ppm处为苯环上的邻位质子峰，δ=8.144 ppm处对应为长链上苯环的邻位质子峰，苯环上的间、对位质子峰出现在δ=7.746 ppm处，e处δ=7.26 ppm处为-OH链所连接苯环的间位质子峰，δ=4.163 ppm，二硫键两边碳链上的质子峰分别出现δ=2.881 ppm，δ=2.799 ppm，δ=1.953 ppm，δ=0.810 ppm，所连接的聚乙二醇链的-CH2出现在δ=3.576 ppm处，末端H质子峰出现在δ=3.423 ppm处。

图20 SnTPPC6-S-S-PEG在CDCl3中的核磁1H-NMR图

SnTPPC6-S-S-PEG在水溶液中自组装形成胶束，其外观形貌可以通过扫描电子显微镜观察，首先将SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束用双纯水溶解，然后用移液枪将其缓慢滴加到预先处理硅片上，常温下置于真空干燥箱中使其干燥过夜。次日取出保证干燥条件下将样品喷金60 s后放入扫描电子显微镜样品室进行扫描。

将一定量的SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束溶液2 ml，经0.45 μm的水相滤膜过滤移入比色皿后，置于动态光散射仪凹槽中，将温度设为37℃，待基线平稳后进行测试。

下图21为扫描电镜下的SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束照片，用扫描电子显微镜测得胶束粒径大小分别为98.4 nm，98.5 nm，98.7 nm及99.1 nm，粒径大小分布均匀。

图21 SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束在扫描电镜下的照片

通过动态光散射测试仪对溶液的粒径进行测定。如图22所示：动态光散射测得粒径为81.59 nm和103.47 nm，其平均粒径为91.33 nm。

图22 SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束的粒径分布图

2.6 SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束的体外光动力学测试

2.6.1 纳米胶束的单线态氧产生能力的测定

用白光作为光源，以1，3-二苯基异苯并呋喃作为捕获剂，通过1，3-二苯基异苯并呋喃在415 nm处紫外吸收强度的变化来定性测试光敏性SnTPPC6-S-S-PEG产生单线态氧的能力。在室温下，将1，3-二苯基异苯并呋喃溶于N，N-二甲基甲酰胺中配制成5×10-5mol/L的溶液，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入一定量的TPP-OH，使TPP-OH的浓度为1×10-6mol/L，将其放在白光光照下，确定时间间隔为5 min，每次定量移取3 mL混合溶液于透明的石英比色皿中，测定SnTPPC6-S-S-PEG溶液在不同时间的紫外-可见吸收光谱。

以特定波长LED作为激发光源，用1，3-二苯基异苯并呋喃作为捕获剂，通过1，3-二苯基异苯并呋喃在415 nm处紫外吸收强度的变化定性测试光敏剂SnTPPC6-S-S-PEG产生单线态氧的能力。在室温下，先将1，3-二苯基异苯并呋喃溶于N，N-二甲基甲酰胺中配制成5×10-5mol/L的溶液，然后向该溶液中加入一定量的TPP-OH，使TPP-OH的浓度为1×10-6mol/L，将其放在430 nm，功率为3（mW/cm2）特定波长激发光下照射，每隔10 s，每次移取3 mL混合溶液于透明的石英比色皿中，分别测定SnTPPC6-S-S-PEG溶液和TPP-OH溶液在不同时间间隔的紫外-可见吸收光谱。

2.6.2 纳米胶束的单线态氧产生能力的分析

如图23和图24所示：SnTPPC6-S-S-PEG在N，N-二甲基甲酰胺中降解1，3-二苯基异苯并呋喃的紫外-可见吸收光谱图及其吸光度-时间关系曲线可以看出：0～45 min，SnTPPC6-S-S-PEG的斜率为0.017。吸收值与时间在0～45 min基本呈线性关系，说明SnTPPC6-S-S-PEG能够持续稳定释放出单线态氧。

图23 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中降解DPBF的UV-vis吸收光谱

图24 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中降解DPBF的时间相关吸收曲线

如图25与图26分别代表在N，N-二甲基甲酰胺中，TPP-OH和SnTPPC6-S-S-PEG在特定波长下降解1，3-二苯基异苯并呋喃的紫外-可见光谱图，图27是两种化合物在特定波长下分别降解1，3-二苯基异苯并呋喃测定单线态氧产生能力的曲线，曲线的斜率代表单线态氧产生的速率，在0～100 s，SnTPPC6-S-S-PEG与TPP-OH的斜率均为0.012，两者的吸收值与时间变化均呈线性关系，且最后产生的量相同，说明SnTPPC6-S-S-PEG具有持续稳定产生单线态氧的能力。

图25 TPP-OH在特定波长下降解DPBF的UV-vis吸收曲线（DMF）

图26 SnTPPC6-S-S-PEG在特定波长下降解DPBF的UV-vis吸收曲线（DMF）

图27 TPP-OH与SnTPPC6-S-S-PEG在特定波长下降解DPBF的时间相关吸收曲线

3 结论

本文设计并成功合成了SnTPPC6-S-S-PEG这种新型结构的光敏剂，利用UV-vis、FT-IR、1HNMR对其结构进行表征，确定其结构已成功合成。扫描电镜下的形貌和动态光散射下的平均粒径为91.33nm且胶束颗粒分布非常均匀；通过对SnTPPC6-S-S-PEG纳米胶束在白光条件以及特定波长激发光照射条件下产生单线态氧的能力进行测试，SnTPPC6-S-S-PEG在特定波长下不仅具有持续稳定产生单线态氧的能力，而且大大缩短了产生单线态氧的时间，具有良好的光动力学疗法应用前景。