高效液相色谱法测定麻杏石甘口服液中盐酸麻黄碱含量的方法研究

侯丽丽,王 成,武晋孝 ,林桃桃,郭 禹,刘 星

(1.山西省饲料兽药监察所，山西 太原 030027；2.山西鑫华泽药业有限公司，山西 晋中 030900 )

麻杏石甘口服液收载于《兽药质量标准》2017版中药卷，处方由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草组成，具有清热，宣肺，平喘功能，主治肺热咳喘[1]，处方中麻黄为君药。麻黄为麻黄科植物草麻黄(Ephedra sinicd Stapf)木贼麻黄或中麻黄的干燥草质茎。秋季采割绿色的草质茎，晒干。麻黄是特产于中国而闻名于世界的药用植物，具有兴奋中枢神经，诱发出汗，抗过敏、抗流感病毒、利尿等作用，在中医药、蒙医药、西医药中都有广泛的应用。麻黄主要成分为生物碱(1%～2%),总生物碱的80%～85%为麻黄碱(左旋麻黄碱，L-ephedrine)；其次为伪麻黄碱(D-pseudo-ephedrine)等。盐酸麻黄碱为白色针状结晶或结晶性粉末，是麻黄碱的盐酸盐。盐酸麻黄碱也为制造冰毒的重要原料，已被纳入易制毒化学品管理，麻黄碱是中药麻黄的有效成分，也可合成，中毒大多由于过量麻黄碱或麻黄所致，麻黄碱中毒症状的发生主要由于中枢神经系统兴奋和周围的拟肾上腺素作用所引起。麻杏石甘口服液标准中无盐酸麻黄碱的含量测定项，为了更好控制本品质量，本试验对麻杏石甘口服液中盐酸麻黄碱的含量测定方法进行了研究。

1 仪器和材料

Agilent 1260高效液相色谱系统，盐酸麻黄碱对照品，批号171241-201508，纯度99.8%，购自中国兽医药品监察所。麻杏石甘口服液(批号201805066)，阴性样品缺麻黄的麻杏石甘口服液(批号201805066)，250 mL/瓶，均由保定冀中药业有限公司提供。乙腈为色谱级，磷酸、三乙胺、盐酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱条件 根据参考文献[1]方法,色谱柱为 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97)，检测波长为207 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱对照品10 mg，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升含盐酸麻黄碱20 μg的溶液)。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL，置50 mL 量瓶中，加浓氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密称重，超声20 min，放冷，用三氯甲烷补足减失的重量，振摇，过滤，取续滤液25 mL，加入盐酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，残渣加0.1 mol/L 的盐酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加浓氨溶液1 mL，用三氯甲烷定容至刻度，精密称重，超声20 min，放冷，用三氯甲烷补足减失的重量，振摇，过滤，取续滤液25 mL，加入盐酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，残渣加0.1 mol/L的盐酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.5 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.6 系统适用性试验 取供试品溶液10 μL注入色谱仪，记录色谱图，结果表明：盐酸麻黄碱与相邻峰达到基线分离，分离度达到4.22，盐酸麻黄碱峰保留时间为19.5 min，理论板数为22 381，峰面积为183.1，峰宽0.30 min。试验证实，该方法系统适用性良好，见图1。

2.7 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置出相同的峰，阴性样品在与对照品色谱峰相应的位置上，无吸收峰，说明处方中其他成分不影响盐酸麻黄碱的含量测定，结果见图1～3。

2.8 线性关系试验 取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加0.1 mol/L的盐酸溶液制成1 mL含盐酸麻黄碱60 μg的溶液，即得对照品储备液。分别取储备液适量制成60 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL盐酸麻黄碱对照品溶液，滤过，取续滤液，分别按上述色谱条件进样10 μL，测定峰面积。结果见表1。

图1 盐酸麻黄碱对照品HPLC色谱图

图2 麻杏石甘口服液样品HPLC色谱图

图3 麻杏石甘口服液阴性样品HPLC色谱图

表1 线性试验数据

以峰面积为纵坐标，盐酸麻黄碱含量(X-mg/mL)为横坐标作线性回归，回归方程为：y=23.286x + 11.931，R2= 0.999 9，结果表明，盐酸麻黄碱在0.005～0.06 mg/mL(0.05～0.6 μg)范围内，峰面积与盐酸麻黄碱含量呈良好的线性关系。见图4。

图4 盐酸麻黄碱线性关系

2.9 精密度试验

2.9.1 仪器精密度试验 精密吸取20 μg/mL的盐酸麻黄碱对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，连续测定6次，测定峰面积，结果见表2。峰面积RSD为0.34%，结果表明精密度符合规定。

表2 精密度试验数据

2.9.2 重复性试验 取同一批供试品样品，按供试品溶液制备项制备样品溶液，制备6份供试品溶液，各取10 μL注入色谱仪，在上述高效液相色谱条件下进行测定，结果见表3。盐酸麻黄碱含量RSD为 0.87%，表明重复性好。

表3 重复性试验数据

2.9.3 溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL，记录色谱图和盐酸麻黄碱峰面积，结果见表4。供试品12 h内峰面积RSD为1.06%，表明样品在12 h内稳定。

表4 溶液稳定性试验数据

2.9.4 加样回收率试验 (1)对照品溶液制备：取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加0.1 mol/L的盐酸溶液制成每1 mL含盐酸麻黄碱300 μg的溶液，即得对照品溶液。(2)加样回收样品溶液制备：精密量取已知含量(0.38 mg/mL)的同一批麻杏石甘口服液样品0.5 mL，置50 mL量瓶中，加上述对照品溶液0.6 mL，加浓氨溶液1 mL，加三氯甲烷定容至刻度，精密称重，超声20 min，放冷，用三氯甲烷补足减失的重量，振摇，过滤，取续滤液25 mL，加入盐酸乙醇(1→20)溶液4 mL，水浴蒸干，残渣加0.1 mol/L的盐酸溶液溶解，定容至25 mL量瓶中，摇匀，即得。

照上述供试品方法制备6份供试品溶液，取10 μL注入色谱仪，记录色谱图，计算加样回收率。

回收率=(加对照品后测得的含量-加对照品前的含量)/实际所加对照品量×100%。结果见表5,6份样品盐酸麻黄碱的平均回收率为100.22%，RSD为1.47%。

2.10 耐用性试验 取同一批供试品，改变流动相溶液比例(乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)的比例分别为1∶99、5∶95)进行测定；改变检测波长(205 nm，209 nm)进行测定；改变柱温(28 ℃，32 ℃)进行测定；分别用Thermo scientific BDS HYPERSIL C18 (5 μm，4.6 mm×250mm)，Syncroni AQ C18(5 μm，4.6×150 mm)，Agilent XDB C18(5 μm，4.6×250 mm)3种不同的色谱柱进行测定。

表5 加样回收率试验结果

结果同一供试品改变流动相比例后，RSD为0.77%；同一供试品在3个波长下，RSD为0.51%。同一供试品在改变柱温的条件下，RSD为0.46%。同一供试品在更换不同色谱柱下进行测定，RSD为0.66%。表明仪器条件微小变动对测定结果无明显影响。

2.11 样品含量测定 为了充分考虑不同批次产品的含量差异，测定了19个不同批次样品，结果见表6。盐酸麻黄碱的含量在0.10～0.88mg/mL之间。

表6 19批样品含量测定结果

4 讨论

目前，高效液相色谱法测定盐酸麻黄碱含量的流动相主要有甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液系列，《中华人民共和国兽药典》2015版二部，以甲醇0.092%磷酸溶液(含0.04%三乙胺和0.02%二正丁醇)(1.5∶98.5)为流动相测定盐酸麻黄碱的含量[2]，麻杏石甘注射液测定盐酸麻黄碱含量[1]用流动相乙腈-0.1%磷酸(5∶95)采用其测定麻杏石甘口服液中盐酸麻黄碱时发现无法与供试品溶液中其他组分实现有效分离，最终根据参考文献[1-3],以乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3 ∶97)为流动相实现了盐酸麻黄碱的良好分离。

供试品溶液制备时比较直接定容与超声定容提取法的效果，结果表明，超声提取更好，采用超声提取方法，分别超声处理15、20、30 min，测定盐酸麻黄碱的含量，结果表明，超声处理20 min与超声处理则无明显差异，故超声处理时间定为20 min。

本试验建立麻杏石甘口服液中盐酸麻黄碱的 HPLC含量测定方法，简便、准确度高、重复性好，为麻杏石甘口服液质量控制提供了科学依据。