1例土鸡多种病原混合感染引起关节炎的诊断

梁竞臻，徐子恒，王威威，张远琴，石梦雅，汪 敏，韦 平

(广西大学养禽与禽病学研究所，广西 南宁 530005)

鸡关节炎是养禽业中较常见的一种疾病，可由细菌、病毒和支原体引起。其中细菌性关节炎主要是由大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌等引起；病毒性关节炎主要由禽呼肠孤病毒(ARV)引起；支原体病是由鸡滑液囊支原体(MS)引起。此外，某些营养性疾病如日粮中缺乏维生素D、日粮蛋白水平过高引起痛风和缺乏某些必需无机元素时也可引起鸡关节炎的发生[1]。鸡关节炎的主要症状为关节肿胀、发炎、单侧或双侧跛行，严重时病鸡卧地不起，造成行动不便、采食困难等[2]。

近年来，随着我国集约化养鸡业的快速发展，鸡关节炎不再是单一病原引起的疾病，多种病原混合感染引起鸡关节炎的现象普遍发生[3]。目前多发性鸡关节炎的流行在我国养鸡业中呈上升趋势，不仅影响鸡群生长发育，造成死淘率增加，给养鸡业带来巨大的经济损失，同时，由于其病原呈多样性，且症状大多相似，也给疾病的诊断带来困难[4]。2018年10月，广西大学养禽与禽病研究所接诊了一起土鸡混合感染引起关节炎的病例，根据鸡群发病情况、临床症状、剖检病变和实验室病原检测，确诊该鸡群为滑液囊支原体、细菌、禽呼肠孤病毒的单一或多种病原混合感染所致。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基 试剂：革兰染液、瑞氏染色液及常规生化试剂盒，均购自广东环凯微生物科技有限公司；沙门菌属诊断血清(60种)、沙门菌属A～F多价诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司；16种常规药物的药敏纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司；PCR试剂，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA Marker为TaKaRa公司产品。

培养基:缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱盐酸增菌液(SC)、麦康凯培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂(XLD)培养基及普通营养琼脂，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；鲜血琼脂培养基和生理盐水由广西大学养禽与禽病学研究所自行配制。

1.2 流行病学 广西南宁市某养殖公司送检2批(A组和B组)不同日龄的土鸡：A组为4只50日龄土鸡，B组为7只55日龄。发病鸡群大约各10 000羽，于46日龄起开始发病，病鸡表现为羽毛蓬乱、精神萎靡，身体前倾、无法站立，久卧不起、不愿走动；个别鸡只关节肿大、跛行，静卧时倒向一侧；部分病鸡伴有不同程度的拉稀。送检时累计发病率为30%，死亡率为0。

1.3 方法

1.3.1 剖检 扑杀全部送检病鸡并剖检，按鸡的日龄分组(A：50日龄、B：55日龄)，统计病理变化。

1.3.2 禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的检测 ARV的RT-PCR检测：无菌取送检病鸡的关节渗出物、病变组织，剪碎后用无菌研钵充分研磨，并用灭菌生理盐水制成1∶5悬液，反复冻融3次后提取RNA，根据Xie等[5]建立的方法进行ARV的RT-PCR检测。

MS的培养检测：无菌取病鸡肿胀关节渗出物于增菌培养液中，置37 ℃摇床培养24 h，然后用DNA抽提试剂盒的方法提取DNA 样品，参照谢芝勋等[6]建立的 MS 检测法进行PCR检测。

1.3.3 细菌的分离培养鉴定 无菌取病鸡病变组织、骨髓及关节液直接划线，分别接种于鲜血琼脂培养基中，37 ℃培养18-24 h，观察菌落形态，挑取可疑菌落进行革兰染色、瑞氏染色以及常规生化试验鉴定[7-9]。

此外，参照GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》中的培养方法，无菌采集病鸡有典型病变的肝脏、骨髓或关节炎症物1 g，剪碎后置于10 mL缓冲蛋白胨水(BPW)中预增菌，37 ℃培养18-24 h，各蘸取一环增菌液划线接种于麦康凯琼脂平板，37 ℃培养18-24 h，观察菌落形态；同时，分别取上述 BPW预增菌液1 mL于9 mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液中，37 ℃培养18-24 h，分别划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂平板上，继续37 ℃培养18-24 h。挑取XLD平板上可疑沙门菌的单菌落，划线接种到普通营养琼脂平板上纯培养，在37 ℃下培养18-24 h，用沙门菌属A～F多价血清做平板凝集试验和PCR检测，进一步确定是否为沙门菌。PCR检测参照赵志伟论文[10]中提到的沙门菌invA基因PCR试验方法以及耿士忠等[11]论文里提到的鸡白痢rfbS基因特异性PCR试验方法。

1.3.4 分离株药敏试验 将分离到的细菌分别接种到普通营养琼脂平板上进行纯培养，并参考美国临床实验室标准委员会(CLSI)的标准[12]，采取K-B纸片扩散法[13]对分离株进行16种常见药物的敏感性试验。判定标准：抑菌圈直径≤6 mm为不敏感;>6～≤10 mm为低敏;>10～≤20 mm为中敏;>20 mm为高敏。

2 结果

2.1 病鸡病变统计 A组：关节有白色渗出液(2/4)或黄色干酪样物(1/4)、股骨头坏死(1/4)、肝脏发绿(1/4)、肝脏有灰白色坏死点(2/4)。B组：关节有淡黄色混浊黏液(5/7)或淡黄色透明液体(1/7)、关节有黄色干酪样物(1/7)、肌腱出血(1/7)、心包积液(1/7)、肝脏肿大且有灰白色坏死点(2/7)、股骨头坏死(1/7)(见中插彩版图1)。

2.2 ARV和MS的检测

2.2.1 ARV的RT-PCR检测 A组ARV呈阳性(0/2)、B组ARV呈阳性(1/2)，阳性样品在534 bp处扩增出特异性条带，电泳结果见图2。

2.2.2 MS的PCR检测结果 A组MS呈阳性(2/2)、B组MS呈阳性(3/3)，阳性样品在399 bp处扩增出特异性条带，电泳结果见图3。

2.3 细菌分离及鉴定

2.3.1 血平板培养检测 用血平板从关节和肝脏中分离到3种明显不同的细菌。通过观察菌落形态，挑取可疑菌落进行革兰染色、瑞氏染色以及常规生化试验鉴定，根据其结果，初步鉴定为大肠杆菌(1/11)、葡萄球菌(3/11)和溶血性巴氏杆菌(1/11)。

2.3.2 国标培养检测 参照国标方法来进行培养的检测结果显示：大肠杆菌(2/11)、沙门菌(1/11)。其中，经血清学、生化试验及PCR检测确定沙门菌血清型为鸡白痢沙门菌。图4为沙门菌属invA基因PCR结果和鸡白痢沙门菌rfbS基因PCR结果。从图4发现分离株中均在invA基因的目的条带395 bp左右处有阳性扩增，为沙门菌；在rfbS基因的目的条带400 bp处有阳性扩增，为鸡白痢沙门菌。

图2 ARV PT- PCR检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：ARV阴性对照；2：ARV阳性对照；3：阳性样品ARV引物基因的扩增

图3 MS PCR检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：MS阴性对照；2：MS阳性对照； 3～4：A组样品MS引物基因的扩增； 5～7：B组样品MS引物基因的扩增

图4 沙门菌PCR检测结果

M：DL-2 000 DNA Marker；1：invA基因阴性对照；2：invA基因阳性对照；3：样品invA基因的扩增；4：rfbS基因阴性对照； 5：rfbS基因阳性对照；6：样品rfbS基因的扩增

2.4 两群鸡各病原检测情况 A组各病原检测结果：细菌培养检测中，葡萄球菌(1/4)、大肠杆菌(2/4)、沙门菌(0/4)、溶血性巴氏杆菌(1/4)，ARV PT-PCR检测阳性(0/4)，MS培养检测阳性(2/2)。见表1。

表1 A组各病原检测情况

+:为阳性检测结果,下表同

B组各病原检测结果为：细菌培养检测中，葡萄球菌(2/7)、大肠杆菌(2/7)、沙门菌(1/7)、溶血性巴氏杆菌(0/7)，ARV RT-PCR检测阳性(1/7)，MS培养检测阳性(3/3),见表2。

表2 B组各病原检测情况

2.5 分离株药敏试验 药敏试验结果显示：4种分离菌株对复方新诺明、萘啶酸、磺胺异噁唑、甲氧嘧啶均不敏感；对头孢曲松、呋喃妥因高敏；对头孢噻肟、头孢他啶、阿米卡星、链霉素、卡那霉素、四环素、环丙沙星和庆大霉素均产生不同程度的敏感性。

3 讨论

近年来，随着我国养鸡业规模化和集约化水平的提高，单一营养因素引起的鸡关节炎逐渐减少[14]，然而，在鸡的生产性能不断得到提高的同时，由不利环境因素和多种病原引起混合感染的鸡关节炎病不断增加，成为一个严重制约养鸡业发展的问题。这种病比单一感染更多见，而且诊断难度加大。由于鸡关节炎病原呈多样性，引起的临床症状相似，肉眼一般很难鉴别诊断，需要应用实验室诊断技术确诊[15]。

本病例中，根据流行病学、剖检病变、实验室病原检测结果以及这些鸡群均未接种ARV弱毒疫苗和发病后也未使用任何药物等情况，最终确诊送检鸡群为MS、细菌、ARV的单一或多种病原混合感染所致。按照感染类型划分，A组：单一细菌感染引起关节炎2只(50%)；单一MS感染1只(25%)；细菌和MS混合感染1只(25%)。B组：单一细菌感染引起关节炎3只(42.9%)；单一MS感染2只(28.6%)；细菌和MS混合感染1只(14.3%)；细菌和ARV混合感染1只(14.3%)。结果显示，单一细菌感染的比例较高，其中分离到大肠杆菌(2/5)、葡萄球菌(2/5)、鸡白痢沙门菌(1/5)。对比本实验室近10多年接诊的病例检测记录发现，由大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌等环境中常见的条件性致病菌引起的细菌性关节炎较为常见[4,15-16]。细菌可广泛存在于带菌鸡排出的粪便、污水以及潮湿的生活环境中，一旦感染，可在鸡体内滋生繁殖，如果其伴随体液进入关节腔便会引起鸡体关节肿大[17]。为避免水平传播，鸡群饲养多为笼养，但Wideman等[18]研究表明，在铁丝网上笼养的鸡，由于网面的不稳定性，会促进细菌的增殖，因此很大程度上加重细菌性股骨头坏死的发生。本病例中，从股骨头坏死的病鸡中只分离到了细菌，没有检测到其他可引起关节炎发病的病原，与其他该类型病例检测结果相符[17,19]。从药敏试验结果可以看出，分离株对复方新诺明、萘啶酸等抗生素均不敏感。尽管该鸡场发病后未使用任何药物，但多数养殖场将抗生素作为饲料添加剂使用，已使病原菌产生了较强的耐药性。

本次发病鸡群中，MS、ARV也是引起发病的原因之一。MS传播方式广泛，鸡群一旦感染，不易彻底清除，且易混合感染其他疾病，使病情复杂化[3]。此次病原检测结果显示，两组鸡中均出现细菌和MS混合感染的现象，各分离到的1株细菌，分别为溶血性巴氏杆菌和大肠杆菌。MS目前尚无有效的特异性治疗方法，主要通过有效的生物安全措施和鸡群净化进行防控[1]，也可通过弱毒疫苗和灭活油苗控制感染，减少损失[15]。据了解，该鸡群未免疫过MS疫苗，这可能是导致鸡群感染MS的原因之一。本次病例中，ARV只在B群1只鸡中检测到，同时分离到了葡萄球菌，说明ARV不是该病发生的主要原因，但也应引起重视。欧阳文军等[20]研究表明，禽类在感染ARV后，可以加重其他病原体引起的疾病。

综上所述，引起鸡关节炎的因素较多，病原呈多样性，也给疾病的诊断带来一定难度。鸡关节炎发生后，首先应用实验室诊断技术进行确诊，然后再根据不同的病因制定防控措施。针对该鸡场发病的情况，可采取以下措施进行后续防治工作：(1)加强养殖场日常饲养管理，严格制定并实施合理的生物安全措施；(2)加强种鸡群净化工作，对发病鸡应及时淘汰，以防疾病通过垂直传播给后代，造成肉鸡的垂直感染；(3)应结合药敏试验选用敏感度高的药物进行治疗，可用不同药物轮换使用，避免因使用单一药物而产生耐药菌，平时也应减少抗生素在饲料、饮水中的使用；(4)可将MS、ARV疫苗接种纳入免疫程序中，加强鸡群免疫及其效果，避免MS、ARV感染带来的经济损失。