貉源肺炎克雷伯菌的分离鉴定与药敏试验

柳 佳，李永秀，李 婧，喻桂婧，潘素敏，肖佳孟，史秋梅，王秋悦

(1.河北科技师范学院动物科技学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 063000；2.唐山动物园，河北 唐山 063000；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)属肠杆菌科、克雷伯菌属，是肠道有荚膜的革兰阴性杆菌，典型的人兽共患条件性致病菌[1]。该菌广泛存在于机体消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，常引起人畜重症肺炎、泌尿道、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病，若治疗不当，死亡率极高[2-3]。吕媛等报道肺炎克雷伯菌能引起新生儿的败血症，该菌易产生耐药性[4]。肺炎克雷伯菌广泛存在环境中，能引起猪、山羊、梅花鹿、牛等多种动物发病，主要引起肺炎、脑膜炎、肝脓肿甚至和全身败血症等,发病率与死亡率都较高[5-6]。

随着毛皮动物狐、貉、貂养殖量增加，肺炎克雷伯菌引起的狐、貉、貂发病越来越多。钟世勋等报道，2012-2013年间，山东地区10个地市毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)肺炎克雷伯菌感染率为37.58%[7]。肺炎克雷伯菌对毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)的养殖存在潜在威胁，应引起重视。

河北省某地区貉子养殖厂，貉子突然发病，临床表现为精神沉郁、蜷缩，食欲不振，结膜苍白，呼吸急促、偶见咳嗽、鼻腔有分泌物，站立不稳，有的还出现了腹泻，头部、颈部出现脓包等。本试验对病死貉无菌采集肺脏、肝脏、淋巴结等病变组织，分离出单一菌株，采用常规鉴定方法和16S rRNA PCR方法，确定分离菌株HM-1为肺炎克雷伯菌，该菌具有致病性，并通过药敏试验分析其耐药谱，为下一步预防和控制该病流行提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 肺炎病死貉，无菌操作采集具有典型病理变化的肺脏、肝脏和脾脏等病料。

1.2 主要试剂与仪器 血平板培养基、S.S.培养基、营养肉汤(生工生物工程(上海)股份有限公司)；琼脂糖(香港基因有限公司)；ID32E肠道菌鉴定试条(BioMerieuxsa公司)；药敏纸片(浙江省杭州天和微生物试剂有限公司)；2×TaqMaster Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)；树脂型TM基因组DNA提取试剂、PCR所用引物、GoldViewTM核酸染料和DM-2 000(北京赛百盛生物技术有限责任公司)。高压灭菌器(上海博讯实业有限公司)；智能型电热恒温培养箱(上海琅玕试验设备有限公司)；PCR仪(Mastercycler gradient,德国Eppendorf公司)；双稳定时电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像分析系统(美国SIM公司)。

1.3 实验动物 20 g左右健康BALB/c小鼠8只，购于北京维通利华实验动物有限公司。

1.4 细菌分离培养与纯化 无菌取病死貉的肺脏、肝脏和脾脏，接种于血平板培养基上，37 ℃培养12-16 h；挑取典型的单菌落接种划线普通培养基和S.S.培养基上进行细菌的纯培养；纯化培养后，提取优势菌落接种在营养肉汤培养基中37 ℃、200 r/min恒温震荡培养，并挑取纯培养的单菌落涂片，革兰染色，显微镜下观察细菌形态。

1.5 细菌生化特性鉴定 按说明书进行操作，用自动生化鉴定系统ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化试验。

1.6 细菌分子生物学鉴定 用营养肉汤纯培养细菌，按照说明书提取DNA基因组，根据细菌16S rRNA序列设计的通用引物，对细菌的16S rRNA基因片段进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为30 μL，包括2×TaqMaster Mix 15 μL，上下游引物各1 μL，菌液2 μL，超纯水补足至30 μL。PCR反应条件为：预变性94 ℃，3 min；变性94 ℃，30 s；退火55 ℃，40 s；延伸72 ℃，1 min；35个循环；延伸72 ℃，5 min。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性比对分析，用DNASTAR软件构建系统进化树，并进行同源性分析。

1.7 动物致病性试验 根据相关文献[8]，将8只试验小鼠分为2组。第1组为试验组，每只腹腔接种的剂量为0.25 mL(107CFU/mL)菌液；第2组为空白对照组，接种等量营养肉汤，接种12 h后，观察小鼠发病状况和死亡情况，对死亡小鼠无菌采集肺脏、肝脏和脾脏,进行分离鉴定。

1.8 药敏试验 参照K-B纸片法进行试验和结果判断[9]，在无菌条件下，用无菌棉签蘸取菌液，均匀涂布在普通培养基上，用无菌镊子取药敏纸片，贴于培养基表面，37 ℃培养12-16 h，测量药敏纸片抑菌圈直径并判断其敏感性。

2 结果

2.1 临床症状及剖检 病貉临床表现主要为精神沉郁、蜷缩，食欲不振，结膜苍白，呼吸急促、偶见咳嗽、鼻腔有分泌物，站立不稳，有的还出现了腹泻，头部、颈部出现脓包等；剖检变化为上呼吸道黏膜充血水肿，肺充血、出血、气肿；肝脏明显肿大、质脆硬、出血，切面外翻，流出暗红色、凝固不良的血液；脾肿大。

2.2 细菌分离培养和形态学观察 分离菌株HM-1在血平板培养基上，37 ℃倒置培养12 h后，可见培养基表面生成圆凸、光滑湿润、半透明、粘稠的菌落，拉动呈丝线状(见中插彩版图1A)；在S.S.培养基上可见培养基表面生成粉红色圆凸、湿润的菌落(见中插彩版图1B)；革兰染色镜检，发现存在两端钝圆、浓染的革兰氏阴性粗短杆菌，呈单个、成对或短链状排列(见中插彩版图1C)。

2.3 细菌生化鉴定 采用自动ATB细菌鉴定仪，利用ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化鉴定，分离菌株HM-1氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性，发酵D-葡萄糖产酸产气，可以利用木糖、果糖、D-葡萄糖等作为碳源，甲基红试验、V-P试验阳性、不产生H2S，精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、接触酶、尿素酶为阴性，生化鉴定结果为肺炎克雷伯菌。与李超等[8]报道一致。

2.4 16S rRNA测序与系统进化树的构建 利用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，结果显示，得到1 500 pb左右的条带(图2)；将上述菌株的16S rRNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，并使用MEGA8.1对分离菌株的16S rRNA序列与其他相似性较高的种属的16S rRNA序列进行多序列匹配排列，构建系统发育树，结果表明，菌株与克雷伯菌F2R9以及01A030聚为一支，相似度为最高，达到99.8%，而与其他菌株的遗传距离较远一些，所以从系统发育树和序列相似度上来看，分离到的菌株与克雷伯菌较近些(图3)。

图2 分离菌株HM-1 16S rRNA PCR扩增电泳结果

M：DL-2 000 Marker；1、2、3：PCR产物

图3 分离菌株HM-1 16S rRNA基因序列系统发育树

2.5 动物致病性试验 试验组的4只小鼠在接种后12 h，出现精神沉郁、拒食拒饮、蜷缩不动、呼吸急促，36 h出现了死亡，剖检死亡的小鼠，肺部呈现出血、肿大，无菌采集小鼠肺脏、肝脏、脾脏等组织分离培养鉴定。结果显示，所分离菌与该病病原菌HM-1一致。对照组4只小鼠健康存活，表明该菌有一定致病性。

2.6 药敏试验 对14种抗生素进行了药敏试验(表1)，结果显示：分离菌株HM-1仅对头孢噻肟高度敏感；对头孢曲松、新霉素、卡那霉素3种药物中度敏感；对青霉素、林可霉素、氧氟沙星等10种抗生素高度耐药。

3 讨论

肺炎克雷伯菌属包括肺炎克雷伯肺炎亚种、臭鼻亚种及鼻硬结亚种，其中肺炎克雷伯肺炎亚种分布最为广泛，是引发动物及人呼吸道感染主要病原菌之一，是常见的条件性致病菌[10]。近年来，有关肺炎克雷伯菌引起人和动物疾病的报道在迅速增多，尤其是毛皮动物(狐狸、 貉子、 水貂)，严重地威胁着养殖业的发展。

表1 药敏试验结果/mm

药物敏感性判定标准RIS抑菌圈直径结果氟苯尼考Florfenicol≤1415^18≥190R恩诺沙星Enrofloxacin≤1011^15≥160R阿莫西林Amoxicillin≤1314^17≥180R氧氟沙星Ofloxacin≤1213^15≥160R青霉素Penicillin≤1415^17≥180R氨苄西林Ampicillin≤1415^17≥180R复方新诺明Compound sulfamethoxazole≤1011^15≥160R诺氟沙星Norfloxacin≤1213^16≥170R环丙沙星Ciprofloxacin≤1213^16≥170R卡那霉素Caramycin≤1314^17≥1814I林可霉素Lincomycin≤1415^20≥210R新霉素Neomycin≤1011^15≥1612I头孢曲松Cefatriaxone≤1415^17≥1816I头孢噻肟Cefixime≤1415^17≥1820S

S:高度敏感；I:中度敏感；R:耐药

本试验通过对送检的肺炎病死貉，无菌采肺脏、肝脏和脾脏等病料，分离出1株菌HM-1，采用常规的分离鉴定方法和16S rRNA PCR方法，确定为肺炎克雷伯菌，致病性试验表明，该菌为致病菌，在分离菌的过程中，只分出单一的肺炎克雷伯菌，证实了该菌是引起貉肺炎的主要病原菌。钟世勋等[11]报道了从肺炎病死的貉体内分离出2株致病性肺炎克雷伯菌。该菌广泛存在于环境中，主要通过呼吸道感染，尤其在高密度养殖过程中或者外界条件发生改变时，导致机体的免疫力低下，容易发病，不易控制[12]。

药敏试验结果显示：14种抗生素中，仅对头孢噻肟高度敏感；对新霉素、头孢曲松和卡那霉素中度敏感；对10种抗生素高度耐药。由于近年来抗生素的滥用导致细菌产生耐药性的现象愈加严重，导致肺炎克雷伯菌可产生耐药菌株。孙虎芝等[12]报道，水貂的肺炎克雷伯菌在24种药物中，37.5%的药物耐药，也出现很强的耐药性。林星宇等[13]报道了猪源肺炎克雷伯菌对四环素、环丙沙星、复方新诺明等19种常用药物耐药，出现了多重耐药菌株。许多文献报道，肺炎克雷伯菌对头孢菌素不敏感，可能与该菌的耐药机制有关[14]。肺炎克雷伯菌耐药性与感染的宿主(水貂、猪、貉)不同，其敏感性也不同，也可能与地区有关系。根据肺炎克雷伯菌流行特点，因此当养殖场发生疾病时，应根据药敏试验结果选择敏感药物进行合理的用药，才能起到良好的治疗效果。