不同浓度表皮生长因子(EGF)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

段步婷，席 柔，李瑞琪，张雪松，张 黎，古少鹏，郑明学，白 瑞

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

鸡球虫病不利于全世界养禽业的持续健康发展[1]，而9种球虫中危害最大的是柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)[2]，其主要侵害盲肠。由于现阶段关于鸡球虫病的入侵和损伤机制的研究并不充分，也就无法研制抑制或阻断E.tenella损伤宿主细胞的药物[3]。目前大部分关于E.tenella的研究通常将原代鸡肺上皮细胞以及鸡胚肾细胞作为宿主细胞[4]，但是事实上盲肠上皮细胞才是E.tenella的宿主细胞。因此为了更好地研究E.tenella损伤机制以及抗球虫药，所以需要研究盲肠上皮细胞体外培养技术。

表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是调节细胞周期的一种外源性因子，它对细胞周期的调节作用主要表现在可以缩短细胞分裂的时间[5]。EGF的肽链由50～60个氨基酸构成，每条链中含有6个半胱氨酸分子，各个半胱氨酸分子间形成稳定的双硫键，使整条肽链成为3个环联部分的活性物质。EGF发挥作用主要是通过与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的结合，激发受体内在的络氨酸激酶的活性，从而启动信号传导级联，导致多种生物化学变化，细胞内钙水平上升，增加糖酵解与蛋白质合成，增加某些基因(包括EGFR)的表达，最终导致DNA合成和细胞增殖，因此EGF对细胞的生长和增殖有明显的调节作用[6-7]。有研究证实，EGF对牛前脂肪细胞、牛输卵管上皮细胞、羊毛囊干细胞、小鼠精原干细胞、人表皮细胞、视网膜色素上皮细胞等有促进生长、增殖的影响[8-12]。但是关于鸡盲肠上皮细胞的影响的报道并不多见。本试验对鸡胚盲肠上皮细胞进行不同浓度EGF的刺激培养，探究EGF是否能促进鸡胚盲肠上皮细胞增殖生长，选出最适合盲肠上皮细胞生长的培养体系，为体外建立鸡胚盲肠上皮细胞系和适合E.tenella繁殖的细胞模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 15日龄鸡胚,购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋孵化而来。

1.1.2 主要试剂 PBS(Solarbio公司);胎牛血清(四季青公司);表皮生长因子(EGF，Sigma公司);0.4%台盼蓝(Solarbio公司);DMEM/F12培养基(Sigma公司);0.25%胰酶-EDTA(Gibco公司);二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司);MTT试剂盒(Solarbio公司);嗜热菌蛋白酶(Sigma公司);碱性磷酸酶(Sigma公司);肝素钠(Sigma公司);胰岛素(Sigma公司);丙酮酸钠(Solarbio公司);L-谷氨酰胺(Solarbio公司);青链霉素混合液(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 正常鸡胚盲肠上皮细胞的培养 取15日龄的SPF鸡胚，在无菌环境下取出盲肠，纵向切开盲肠，然后置于含双抗预冷的D-PBS中漂洗35次，去除污血。用眼科镊去除周围的肠系膜用眼科剪将盲肠组织剪碎，剪碎后的组织加入50 μg/mL嗜热菌蛋白酶，然后将其置于振荡培养箱中120 min(37 ℃，80 r/min)，从而起到震荡消化的作用。取出消化组织，加入PBS液终止消化并用吸管轻轻吹打5 min，待细胞块完全散开后，经120目不锈钢筛过滤，将过滤液转入离心管，继续加PBS至悬浮液清亮，然后将其放置于离心机中5 min(1 000 r/min)，去掉PBS和酶液。离心所得沉淀用含10%胎牛血清(FBS)的细胞培养基(1.5 mL/鸡胚)重悬并混匀，2.5 mL/瓶接种于细胞培养瓶内，贴壁培养70 min(41 ℃、8%CO2)，用来去除成纤维细胞。取出细胞贴壁瓶并轻轻摇晃，将沉至瓶底的细胞团块重新悬浮，收集贴壁瓶中的悬液，将悬液放置于离心机中5 min(1 000 r/min)，沉淀用含2.5%FBS的原代细胞培养基悬浮并收集培养瓶中的悬液，离心计数，将细胞团块以20万(2 mL)/孔接种于细胞培养板内，放置于CO2培养箱内(41 ℃、8%CO2)，定期换液(48 h/次)，期间每天观察细胞的生长情况。

1.2.2 EGF对鸡胚盲肠上皮细胞增殖率的测定 在处于对数成长期的细胞中加入适量的0.25%胰酶-EDTA从而起到消化的作用，然后将细胞接种于96孔板内(2×104个细胞/孔)，放置于CO2培养箱中12 h(41 ℃、8%)，然后去除上清液后设置每组EGF的浓度分别为0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL，每一浓度3个孔。放置于CO2培养箱中孵育4 d(41 ℃，8%)，孵育期间每间隔2 d进行1次换液。EGF作用4 d后，加MTT溶液20 μL/孔。于41 ℃、8%CO2培养箱中继续孵育4 h，用胶头滴管吸弃上清液。然后每孔加150 μL DMSO，转移到酶标仪上在490 nm波长下测定各孔吸光度值，每组取3个平行样本的平均值。

1.2.3 鸡胚盲肠上皮细胞生长曲线(率)的测定 通过确定出最佳浓度EGF，然后配制出适合鸡胚盲肠上皮细胞生长的培养基，然后将细胞接种于96孔板内(2×104个细胞/孔)，进行培养。于细胞接种后1-8 d每天用MTT法检测细胞活力(每组每天3孔)，未计数细胞每2 d换液1次。自动酶标仪490 nm测定OD值，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 碱性磷酸酶染色 采用古少鹏等[13]方法，将制备的鸡胚盲肠上皮细胞悬液接种于胎牛血清包被过的爬片上，置于48孔培养板中放在培养箱中培养(41 ℃，8%)，待细胞长至80%时，用预冷的PBS漂洗3次，10%多聚甲醛固定2 h，偶氮偶联法染色，光镜下观察。

1.3 统计学处理 使用SPSS Statistics V22.0统计学软件对试验结果数据进行单因素ANOVA检验，各组试验结果以平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 鸡胚盲肠上皮细胞形态学观察 添加不同浓度的EGF与鸡胚盲肠上皮细胞中，在培养基中不添加EGF的培养72 h后，放在倒置显微镜下观察细胞呈圆形(见中插彩版图1A)；向培养基里添加10 ng/mL的EGF作用72 h后，细胞的数量增多，而且向外伸展(见中插彩版图1B)；添加20 ng/mL的EGF的细胞数量明显增多，而且呈现铺路石样(见中插彩版图1C)；添加30 ng/mL EGF，细胞数量也明显增多，与20 ng/mL组细胞数差异不明显(见中插彩版图1D)；40 ng/mL细胞数量较30 ng/mL细胞数差异不明显(见中插彩版图1E)，添加20 ng/mL的EGF生长5 d，可见细胞排列紧密被一层膜包裹，形成上皮膜(见中插彩版图1F)。

2.2 碱性磷酸酶染色 原代鸡胚盲肠上皮细胞，经碱性磷酸酶染色呈棕黄色，在高倍显微镜下观察，胞浆内可见棕色色素颗粒(见中插彩版图2)。

2.3 EGF对鸡胚盲肠上皮细胞增殖的测定结果 与不添加EGF组相比，EGF在10 ng/mL时，对鸡胚盲肠上皮细胞的增殖有明显的促进作用(P<0.01)，EGF在20 ng/mL时促增殖效果最明显，且差异极其显著(P<0.01)，在30 ng/mL时鸡胚盲肠上皮细胞略有增长，但细胞增殖差异不显著(P>0.05)，在40 ng/mL时，它的促增殖效果降低的非常明显(P<0.01)，如图3。

图3 EGF对鸡胚盲肠上皮细胞增殖的影响

注：图中同一列数据大写字母完全不同者为差异极显著(P<0.01)

2.4 鸡胚盲肠上皮细胞体外生长曲线测定 体外培养1-2 d的鸡胚盲肠上皮细胞生长缓慢，第3天开始迅速生长，进入对数生长期，第4天达到峰值，第5天开始减缓，进入停滞期(图4)。

图4 鸡胚盲肠上皮细胞生长曲线测定

3 讨论

体外培养细胞培养基中添加生长因子对鸡胚盲肠上皮细胞的生长发挥重要的作用。EGF在动物体液和组织中大量的存在，具有强大的生物学效应[14]。尤其是上皮细胞含量尤为丰富。EGF也在上皮细胞来源的细胞膜上大量分布，是上皮细胞的有效促有丝分裂剂，这是一个不争的事实[15]。而EGF对上皮细胞增殖的焦点主要是体外培养时所选用的浓度。袁睿等[16]使用不同浓度的EGF(0、1、10、20、50 ng/mL)对人毛囊外毛根鞘无色素性黑素细胞增殖及迁移能力进行研究，结果表明，EGF浓度在20 ng/mL时，该细胞增殖和迁移能力最强。郭文平等[17]通过试验证明,EGF的浓度为0.1～1 ng/mL时可以明显的促进人角质细胞的增殖。在本试验中，我们体外在细胞培养基中添加了不同浓度的EGF(0、10、20、30、40 ng/mL)作用72 h后，EGF在0～20 ng/mL随其浓度的升高，促进鸡胚盲肠上皮细胞增殖的效应也逐渐增加，但细胞呈散在的卵圆形。而EGF的浓度为20 ng/mL和30 ng/mL时，鸡胚盲肠上皮细胞数量明显增多，且呈现典型的铺路石样，而且细胞增殖效应最明显，但是两者之间差异不显著(P>0.05)。当EGF的浓度为40 ng/mL时，观察细胞生长较前两浓度无明显变化，但其促增殖的效应随着浓度的升高会有所下降但仍比不添加EGF组高(P<0.01)。这与袁睿的观点一致。笔者认为，20 ng/mL EGF能促进鸡胚盲肠上皮细胞增殖，这主要于培养的来源组织有关，不同种属的动物，细胞的生长环境不同，对生长因子的浓度也不同。

碱性磷酸酶是肠黏膜上皮细胞所特有的酶。该酶凝集于细胞表面，参与细胞内消化及其上皮细胞脱落到肠腔内的细胞外消化过程。因此可以用这种方法来鉴定体外培养的细胞是否为肠上皮细胞。古少鹏等[10]体外培养鸡胚盲肠上皮细胞经碱性磷酸酶染色，结果为阳性，可判断是盲肠上皮细胞。范斌等[18]对新生家兔空肠上皮细胞进行碱性磷酸酶染色为阳性，鉴定为兔结肠上皮细胞。杨文平等[19]体外培养至11 d的鸡小肠上皮细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性。贾国东等[20]原代分离培养的鸡小肠上皮细胞进行碱性磷酸酶染色呈阳性。在本试验中培养的鸡胚盲肠上皮细胞进行碱性磷酸酶染色，结果呈阳性，这个结果与以前的研究结果相同，所以可以鉴定本试验中培养的细胞为鸡胚盲肠上皮细胞。

4 结论

本试验结果表明，一定浓度范围内的EGF对鸡胚盲肠上皮细胞有促进增殖生长的作用，当浓度升高，其增殖作用明显降低。从细胞形态学、生长曲线和碱性磷酸酶鉴定上与前人研究的肠上皮一致，符合肠上皮细胞的生长规律。本试验中在体外细胞培养基中添加20 ng/mL EGF对该细胞增殖有促进作用，为构建鸡胚盲肠上皮细胞系奠定了一定的基础。