鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

朱春红，陶志云，刘宏祥，徐文娟，章双杰，李 非，唐燕飞，蒋莲华

(1.江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125；2.广西富凤集团农牧有限公司，广西 南宁 530000)

沙门菌是一种常见的人兽共患病病原，部分血清型沙门菌在家禽生产过程中的感染和污染严重影响家禽生产效率，危害养禽业[1-3]。鸡伤寒沙门菌的两种不同的生物型-鸡白痢沙门菌(Salmonellapullorum)和鸡伤寒沙门菌(Salmonellagallinarum) (简述鸡白痢和鸡伤寒沙门菌),分别引起鸡白痢(Pullorum disease) 和鸡伤寒(Fowl typhoid)，都是鸡的重要致病菌。一般情况下,鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内幼雏,引起白色下痢,病死率极高,在成年鸡仅有零星死亡,但可成为无症状带菌者,带菌母鸡经卵巢垂直传播。而鸡伤寒沙门菌对雏鸡、成年鸡均可致病,常引起贫血、白细胞增多、出血为特征的急性脓毒败血症,死亡率可高达10%[5-6]。在美国和欧美国家，通过严格的净化措施，基本控制鸡白痢与鸡伤寒对家禽生产的影响，而与西方发达国家的情况明显不同的是，在我国以及众多发展中国家的鸡群中还普遍存在鸡白痢与鸡伤寒，严重危害养禽业的发展。

国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》提出，2015年全国祖代以上种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准，2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准。但目前我国部分育种场，曾祖代、祖代种鸡场鸡白痢抗体检测结果很不理想，祖代种鸡场仍然有部分鸡出现鸡白痢抗体阳性，建立新的快速准确的检测方法有望加速此进程。鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌具有相同的菌体抗原，常用的血清学方法不能区分两者。对两者的区分主要依据生化特性的差异，他们对麦芽糖、卫矛醇、鸟氨酸等的发酵模式不同，但上述方法存在许多不足之处，耗时，重复性差。本试验中建立的快速PCR鉴定方法，能快速准确鉴定同一血清型不同生物型沙门菌，在普通实验室平台上即可以实施。

1 材料与方法

1.1 菌株 本试验所用鸡伤寒沙门菌-生物型鸡白痢沙门菌CMCC50771标准株、生物型鸡伤寒沙门菌CMCC50770标准株,购自中国食品药品检定研究所;大肠杆菌菌株以及56株不同血清型沙门菌，其中鸡伤寒沙门菌4株，鸡白痢沙门菌33株，奥尔巴尼沙门菌6株，山夫顿堡沙门菌3株，伦敦沙门菌1株，婴儿沙门菌2株，鸭沙门菌1株，田纳西沙门菌3株，火鸡沙门菌3株为江苏省家禽科学研究所菌种库保存。

1.2 主要试剂与仪器 2×TaqPlus PCR Master Mix试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;dNTP、DNA Marker DL-2 000,均购自宝生物工程(大连)有限公司;其他常规试剂均为国产分析级产品。PCR仪(Thermo Fisher 公司);MP120-2电子秤(上海肯强仪器有限公司);DYY-604型稳压稳流电泳仪(南京新校园生物技术研究所)。

1.3 PCR引物的设计与合成 根据GenBank已公布的鸡白痢和鸡伤寒沙门菌全基因组序列，以及数据库中其他不同血清型沙门菌全基因组序列，序列分析比对，筛选鸡白痢和鸡伤寒沙门菌血清型特异性基因片段，并根据所获得的基因片段利用Primer Premier 6.0软件设计引物，特异性引物信息如下：引物1-Up: 5′-TCG TTT ACG GCA TTA CAC AAG TA-3′；引物1-Lo:5′-CAA ACC CAG AGC CAA TCT TAT CT-3′；引物2-Up: 5′-TGT CGA CTG GGA CCC GCC CGC CCG C-3′；引物2-Lo:5′-CCA TCT TGT AGC GCA CCA T-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据序列分析结果，引物1和引物2的产物片段大小分别为417 bp和636 bp。

1.4 PCR模板的制备 采用煮沸裂解法[7]制备模板。从固体平板上挑取单菌落接种于液体培养基，37 ℃ 摇床培养过夜；次日取1 mL培养液，12 000 r/min 离心5 min，弃上清；用双蒸水洗涤2次后用200 μL双蒸水重悬，沸水浴10 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清；于-20 ℃ 保存备用。

1.5 PCR扩增体系与程序 10×的PCR缓冲液2.5 μL，浓度各为25 mM的dGTP、dCTP、dATP、dTTP混合物0.5 μL，浓度为2.5 U/μLTaqDNA聚合酶1.25 μL，引物混合物1 μL，于一无菌的PCR反应薄壁管中。加入已制备好的待检测模板1 μL，补水至总体积25 μL即可。PCR扩增程序：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性45 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸1 min,共25个循环，最后72 ℃ 延伸10 min后，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 特异性检测 56份已知血清型沙门菌LB过夜培养后，按1.4模板制备方法准备PCR模板，进行双重PCR特异性检测。

1.7 临床样本检测 采集养殖场疑似鸡白痢与鸡伤寒沙门菌活禽棉拭子20份，将棉拭子接种于无菌的增菌培养基(亚硒酸盐胱氨酸增菌液)37 ℃ 培养12 h。将浑浊培养液按1.4方法进行PCR模板制备，随后进行双重PCR检测。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 鸡白痢或者鸡伤寒菌株经双重PCR后均显示417 bp条带，其中鸡白痢沙门菌菌株仅显示417 bp条带，而鸡伤寒沙门菌菌株经双重PCR结果后有2个条带显示，分别为417 bp，636 bp。上述试验结果与预期序列分析结果相符，如图1所示。

图1 鸡伤寒和鸡白痢沙门菌双重PCR检测结果

M：Marker,DL-2 000；1：鸡伤寒沙门菌；2：鸡白痢沙门菌；3：阴性对照(大肠杆菌)

2.2 特异性检测 本试验中建立的双重PCR检测方法能检测出56株不同血清型沙门菌中的4株鸡伤寒沙门菌和33株鸡白鸡沙门菌，以其他血清型沙门菌为模板时，双重PCR检测结果显示为阴性，这一结果说明本试验中建立的双重PCR方法能准确检测出鸡白痢与鸡伤寒菌菌株，与其他血清型沙门菌具有较好的区分。

2.3 临床样本检测 如图2所示，20份样品中，共有9份为阳性，其中含有鸡白痢沙门菌8份(泳道1、3、7、8、11、14、17和18)，鸡伤寒沙门菌1份(泳道5)。说明本试验建立的方法可以很好的利用于临床样本的检测。

图2 临床样本双重PCR检测结果

1～20：不同临床样本；M：DL-2 000

3 讨论

PCR技术是一种体外酶促扩增DNA技术，具有速度快、特异性强、灵敏度高等特点。运用PCR技术检测沙门菌，其特异性主要取决于所扩增的靶序列是否是沙门菌高度保守的特异性片段以及引物的设计[8]。

为了增加对鸡白痢沙门菌检测的特异性，研究者建立了许多基于基因水平检测的方法[9]，如PCR-RFLP，这种方法需要进行2个步骤才能达到检测的目的，即PCR和RFLP[10]；目前已有针对鸡伤寒沙门菌检测的等位基因特异性PCR方法，但该方法不能特异性地鉴定鸡伤寒沙门菌不同生物型—鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌，本试验在分析不同血清型沙门菌全基因组序列的基础上，筛选出鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌特异性基因序列，并以此为基础设计2对引物，建立起双重PCR方法鉴定鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌。

对已经过血清学鉴定的56株不同血清型沙门菌进行上述双重PCR特异性检验，本试验结果和细菌学结果完全一致，能将56株不同血清型沙门菌中3株鸡伤寒沙门菌和33株鸡白痢沙门菌菌株准确区分出来，这一结果表明，试验建立的双重PCR方法特异性较好。进一步将上述已经建立的双重PCR方法应用于临床样本检测，对临床20份可疑样本检测结果显示，8份鸡白痢沙门菌阳性和1份鸡伤寒沙门菌阳性检出，这说明，这一方法可以应用于有简单实验室配置的生产企业。