晋北 晋中 晋南地区冬季舍饲羊场真菌气溶胶差异分析

张艳冰，郭 耀，乔婷婷，白燕雨，刘佳琪，段晋伟，高晓莎，于 欢，唐 芳，霍乃蕊，古少鹏

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

畜禽养殖过程中不断产生真菌气溶胶并向周围环境扩散，对畜禽和养殖人员健康构成严重威胁[1]。真菌粒子进入呼吸道或定殖于体内，使人畜免疫力降低，诱发真菌性肺炎、皮肤感染、过敏性哮喘、真菌毒素中毒等疾病[2-4]。微生物气溶胶受多种因素影响，主要与气象状况、饲养管理和养殖环境等有关，且其危害程度与微生物种类、浓度和气载微生物粒径密切相关[5-6]。气溶胶是养殖场真菌性疾病的主要传播途径，尤其是在现代化的畜禽养殖中，真菌性疾病多发，造成严重的经济损失，目前鸡舍、兔舍、猪舍、鹿舍及奶牛舍真菌气溶胶已进行过较为系统的研究，有关羊场气载真菌的研究鲜有报道[1，7-11]。我们前期研究发现养殖场气载微生物多来源于粪土，羊舍气载真菌浓度高于封闭式的猪舍和鸡舍，约80%的真菌气溶胶粒子可以进入人和动物的肺泡，潜在威胁极大[12-13]。山西省是全国养羊大省，养殖集约化程度较高，冬天圈舍封闭，环境质量差，疾病多发[14]，且全省南北跨度较大、气候差异显著，舍内羊群密度、温度、湿度及饲养模式均有差异，羊场气载真菌种类、优势菌属、真菌气溶胶分布特点及危害程度均有待深入研究。本试验对晋北、晋中和晋南3个地区的9栋半封闭式羊舍气载真菌的组成、浓度、粒径分布、多样性与相似性特征进行了测定和分析，以期为羊场真菌气溶胶危害评估和环境控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 羊场概况 于晋北、晋中、晋南各选取3栋规模相当的半封闭式羊舍进行样品采集，结构为单列式地面结构；两侧墙壁设窗，屋顶设无动力风机，左侧设过道，运动场位于舍外右侧。羊场均以饲养湖羊为主，半个月清粪1次。

1.2 试剂及仪器 国际标准Andersen 6级空气生物采样器(Tisch environment，USA)，采样介质为虎红氯霉素琼脂(RBC-青岛海博)；AGI-30液体采样器(辽宁康洁)，采样介质为超纯水(15 mL)；电热恒温培养箱(天津市中环实验电炉有限公司)；马铃薯葡萄糖肉汤(Solarbio，P9240)；真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，D2300)；ERIC-PCR引物(武汉塞维尔生物科技有限公司合成)；PCR扩增仪(Bio-rad)；电泳仪(北京六一，DYY-6C)；凝胶成像系统。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 冬季采样时间为8：00、12:00和17:00，采样器高度距离地面50～70 cm，与羊的呼吸高度相近。Andersen 6级采样器空气流量为28.3 L/min，驱动时间3 min。AGI-30采样器空气流量8 L/min，驱动时间30 min[15]。每栋羊舍内选取5个采样点，每点每次3个重复。羊舍外环境样本的采样点为该羊舍上风向100 m处,选取3个采样点，每点每次3个重复。

采集对应羊舍的粪土和饲草。测定并记录每次采样时的温度、湿度和风速。

1.3.2 样品处理 Andersen 6级采样器所采集真菌样本于27 ℃生化培养箱中培养72 h，计算各级培养皿上的真菌菌落数(CFU)，继续培养7 d后再进行一次校正计数[16]。将各地区重复采集的液体样品混匀，分别取2 mL接种于4 mL加有双抗(青霉素和链霉素)的马铃薯葡萄糖肉汤中，27 ℃振荡培养3-5 d后提取DNA，用粪土、饲草制备的菌悬液提取DNA。

1.3.3 气载真菌浓度测定 菌落计数校正后根据采样流量和时间计算其浓度(CFU/m3)[13]，以浓度中值进行统计分析。

1.3.4 真菌气溶胶粒谱特征 各采样点真菌气溶胶粒谱特征以计数中值直径(Count median diameter，CMD)表示，真菌粒径分布的离散度以几何标准差GSD表示[17]。人每分通气量按6.94E-03 m3/min计算(10 m3/24 h)[18]、羊每分通气量按5.70E-03 m3/min计算(8 m3/24 h)[19]。

1.3.5 可培养气载真菌的分离鉴定 依据《真菌鉴定手册》[20]、《医学真菌学：实验室检验指南》[21]和《兽医真菌学》[22],对Andersen 6采样器采集到的真菌进行分离、纯化培养、乳酸酚棉蓝染色、光学显微镜观察，鉴别，并分析优势菌属组成。

1.3.6 ERIC-PCR扩增 ERIC引物序列P1为： 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC引物序列P2为： 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。反应体系20 μL，含有：10×PCR Buffer(Mg2+plus) 2.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.6 μL，rTaqDNA polymerase(5 U/μL) 0.2 μL，引物(10 μmol/L) ERIC-1和ERIC-2各1.0 μL，DNA模板(100 ng/μL-1) 2.0 μL(对照用等量双蒸水代替)，双蒸水12.2 μL。PCR反应程序为： 95 ℃预变性5 min；90 ℃变性30 s；52.5 ℃复性1 min；72 ℃延伸1 min(32个循环)；最后72 ℃延伸8 min。产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照用于结果分析。

1.3.7 ERIC-PCR图谱分析 使用Quantity One 4.6.2软件对ERIC-PCR的指纹图谱进行UPGMA(Unweighted Pair Group Mean Average)聚类分析，计算其相似性指数，并构建系统树状图。将ERIC-PCR图谱菌群条带转变为波峰图，用香农-威纳指数(Shannon-Wiener Index， H′)和辛普森优势度指数(Simpson Index， C)表示真菌多样性：

H′=-∑(Pi)(lnPi)

C=∑Pi2

式中Pi=ni/N， ni为每个波峰的面积，N为波峰总面积[23]。

1.3.8 统计分析 采用SPSS Version 22.0和Microsoft Excel 2007 进行数据分析和图表绘制。

2 结果

2.1 3个地区冬季舍饲羊场气载真菌浓度 3个地区羊舍外环境的气载真菌浓度水平由高到低依次为晋南(1 181±428 CFU/m3)、晋中(1 166±183 CFU/m3)和晋北(424±106 CFU/m3)，晋北显著低于其他地区(P﹤0.05)。地区间羊舍内环境真菌浓度差异不显著(P>0.05)，舍内气载真菌浓度均显著高于舍外(P﹤0.05)，为舍外的2.1～9.4倍。

2.2 3个地区舍饲羊场真菌气溶胶粒谱特征

2.2.1 真菌气溶胶粒径分布 羊舍内、外环境中气载真菌均集中分布在采样器的Ⅲ～Ⅴ级(0.65～4.7 μm)，其中外环境Ⅲ～Ⅴ级占比从高到低依次为晋南(88.9%)、晋中(87.1%)和晋北(86.2%)；舍内为晋南(74.0%)、晋中(70.3%)和晋北(63.4%)。峰值均出现在第Ⅳ级(2.1～3.3 μm)，次峰均在Ⅴ级(1.1～2.1 μm)。见图1。

图1 各地区气载真菌粒径分布

2.2.2 真菌气溶胶粒子CMD和GSD值 3个地区羊舍外环境的真菌气溶胶粒子CMD均值由高到低依次为：晋北(2.60 μm)、晋中(2.58 μm)和晋南(2.50 μm)；粒径分布离散度(GSD)为：晋南(2.16)、晋中(2.11)和晋北(2.10)；羊舍内真菌气溶胶粒子CMD均值由高到低依次为：晋北(2.67 μm)、晋中(2.52 μm)和晋南(2.5 μm)；粒径分布离散度(GSD)为：晋南(2.06)、晋中(2.02)和晋北(2.00)。

2.2.3 真菌气溶胶粒子在呼吸道不同部位的到达量 羊舍内环境中每分钟可到达人和羊呼吸道深部的真菌粒子数分别为12.7～16.9 CFU和11.5～13.9 CFU，由高到低依次为晋南、晋中和晋北。见表1。

2.3 晋北、晋中和晋南地区羊场气载真菌的优势菌属 Andersen 6级采样器在3个地区总计捕获活性真菌粒子7 888 CFU，共鉴别出可培养真菌25个属(群)。晋北羊场优势菌属为Cladosporium(35.0%)，Trichophyton(17.1%)，Penicillium(7.7%)和Aspergillus(7.5%)；晋中优势菌属为Penicillium(22.5%)，Aspergillus(21.7%)和Alternaria(9.1%)；晋南的优势菌属为Penicillium(36.1%)和Aspergillus(28.3%)。

表1 人和动物呼吸道不同部位的气载真菌到达量 (CFU/min)

2.4 3个地区羊场样品的ERIC-PCR图谱分析 ERIC-PCR指纹图谱中泳带的数量和位置反映真菌菌群的多样性，泳带的亮暗反映DNA的丰度。外环境的气载真菌样品ERIC-PCR扩增条带数由北向南增加，舍内与外环境规律基本一致，详见图2。

图2 各地区羊场气载真菌、饲料、粪土ERIC-PCR指纹图谱

M： DNA标准参照物；1～9泳道： 羊舍外环境；10～18：羊舍内环境；19～27： 粪土；28～36： 饲草。其中1～3、4～6、7～9： 晋北、晋中、晋南各3栋羊舍外环境的气载真菌样品，其他依次类推

聚类分析结果显示：不同地区样品的ERIC-PCR电泳条带相似性较低，同地区饲草、粪土、气载真菌的菌群组成相似度较高；其中各地区羊舍内气载真菌均与粪土中真菌菌群相似度最高(相似系数0.60～0.70)，见图3。

图3 各地区羊场气载真菌、饲料、粪土聚类分析图

利用Quantity One分析ERIC-PCR图谱显示，各地区羊舍内、外环境的气载真菌菌群和粪土中真菌菌群的Shannon-wiener指数H′均由北向南逐渐增大，Simpson优势度指数C则逐渐减小；饲草中呈现相反规律。见表2

3 分析与讨论

Oliveira M[24]等在2003年研究了葡萄牙波尔多市真菌孢子浓度的季节分布，发现总孢子浓度与风速呈负相关，与温度和相对湿度呈正相关。山西省由北向南其年均温度、年均降雨逐渐升高，本试验发现羊场外环境气载真菌浓度由北向南也呈升高趋势，与Oliveira M等的研究结果一致。但3个地区的羊舍内气载真菌浓度未出现由北向南梯度变化，主要是因为冬季羊舍封闭，受外界环境因素较小，舍内气载真菌浓度与圈舍的通风情况、卫生条件密切相关。本试验测定发现羊舍内气载真菌浓度为羊场外环境的2.1～9.4倍，受地域影响较小，与其他动物圈舍相比，羊舍内的气载真菌浓度高于猪舍和牛舍[25-26]，这可能与动物的生活习性、圈舍结构、饲养管理等因素有关。

表2 不同地区羊场真菌Shannon-wiener多样性指数和Simpson优势度指数

本试验结果显示，真菌气溶胶粒子集中分布在采样器的Ⅲ～Ⅴ级(1.1～4.7 μm)，峰值均出现在Ⅳ级(2.1～3.3 μm)，除与猪舍有所差异外，与鸡舍、牛舍、兔舍均一致[1，26]。研究证实吸入同样剂量的小粒子气溶胶比大粒子的危害更大[27-28]。本试验结果显示，羊舍内可进入并沉降于人和动物呼吸道深部甚至肺泡的真菌粒子由北向南其比例增大，即对人和动物的危害逐渐严重。舍内、外真菌气溶胶粒子CMD值由北向南均逐渐减小，接近甚至小于2.5 μm，而PM2.5细颗粒物可长时间悬浮于空气中，且能通过肺泡血气交换进入血液循环后到达全身各处，从而造成多器官、多系统的损伤[29]。

枝孢霉菌属(Cladosporiumspp)是养殖场常见的优势菌属，可侵染肺部或皮下组织，部分可引起皮肤着色真菌病或系统性暗色丝孢霉病，是真菌过敏症的重要病原之一[30]。毛癣菌属(Trichophytonspp)包括须癣毛癣菌、红色毛癣菌和疣状毛癣菌等，是引起人或动物的皮肤真菌病的主要病原菌，其主要传染途径为空气和接触传播，晋北羊舍的枝孢霉属和毛癣菌属占比高达35%、17.1%，提示该地区羊群真菌性皮肤病感染普遍，应进行流行病学调查，制定相应的控制措施[31]。苗增生等人报道枝孢属、青霉属、曲霉属和链格孢是兔舍内的优势真菌菌属[8]；王雅玲报道，曲霉属和青霉属在山东省部分鸡舍环境中占绝对优势[32]；在本试验中我们发现青霉属和曲霉属是3个地区羊场的共有优势菌属，与兔舍和鸡舍的结果一致。曲霉属(Aspergillusspp)常见的包括黄曲霉、黑曲霉、赭曲霉、烟曲霉等，可产生真菌毒素，引起动物的急慢性中毒，并造成免疫抑制，生长障碍，或诱发癌变，而曲霉菌属主要存在于发霉的饲草中，提示养殖场的干草应存放在通风、干燥的环境中，青贮饲料严格按照制作规程进行，防止腐烂霉变。

ERIC-PCR结果显示，3个地区的舍饲羊场真菌菌群相似性较低，具有明显的多态性，但同圈舍的气载真菌菌群组成与饲草、粪土间相似度较高，可见饲草、粪土是养殖环境中真菌气溶胶的主要来源。Shannon-Wiener指数常与Simpson指数共同使用来反映生物群落的多样性，羊舍内、外气载真菌和粪土菌群的Shannon-Wiener指数均由北向南逐渐增大、Simpson指数则逐渐减小，反映出山西省由北向南羊场气载真菌菌群真菌种属丰富度增高，优势度逐渐减小。饲草中真菌菌群由北向南丰富度降低，优势度增加，与空气中呈相反规律，其原因可能为晋北的牧草种类较多且来源不一，其聚集的微生物种类也相对多样[33]，而晋南的饲草品种和来源相对单一，优势微生物相对稳定。不同地区羊舍的气载真菌菌群差异较大，但均与该羊舍内粪土菌群相似度最高，提示粪土是真菌气溶胶的主要播散源。