骨髓间充质干细胞来源外泌体在疾病中的应用研究进展

骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是来源于中胚层具有多向分化潜能的干细胞[1]，在特定条件下，可分化为不同类型的细胞[2]，如骨、软骨、心肌细胞、上皮细胞和肝细胞等。BMSCs 主要存在于全身结缔组织中，骨髓中含量最丰富，来源充足，容易获得，能在体外培养扩增，广泛应用于多个医学领域，如组织工程、基因治疗和器官移植[3，4]。但随着进一步研究发现，BMSCs 在疾病中发挥作用可能并不是因为其自我增殖分化的特点，而是通过旁分泌机制来实现的[5]，其中外泌体是间充质干细胞旁分泌的重要组成部分[6]。

外泌体（Exosome，Exo）是在上个世纪被发现的，观察到网织红细胞能够分泌一种小囊泡，能介导受体的清除，然而在当时研究者只将其看作是细胞不需要的成分并未关注[7]。直到Zitvogel 等[8]研究证实了Exo 可能是介导细胞间信息交流的重要物质，与其相关研究不断增加。已有研究发现可以从机体体液中分离出Exo，如尿液、唾液、血清、母乳、羊水、恶性胸腔积液等，几乎包括所有的体液[9]。有文献表明间充质干细胞相比其他细胞能够产生足够数量的外泌体，其干细胞的增殖分化特性是通过Exo 进行调控的[10]，目前研究较多的是BMSCs。现对骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSCs-Exo）在各个系统疾病中的最新应用进展作一综述。

1 外泌体生物学特性

1.1 外泌体概念外泌体是特殊的膜外囊泡，其直径为40～100nm，密度为1.13～1.19g/ml，具有稳定的双分子磷脂结构，能保护其自身携带的DNA 片段、miRNA、mRNA 以及功能性蛋白等生物活性物质不被破坏[11]，能通过组织液或血液运输至靶细胞，在细胞间信息传递过程中发挥重要作用，因此可认为是细胞间的通讯信使[12]。

1.2 外泌体的形成与生物学功能

1.2.1 外泌体形成过程 外泌体的形成是按照特定方向进行的，最初部分细胞膜向内凹陷形成早期核内体，接着再次凹陷并选择性地包裹胞浆内的蛋白质、脂质及核酸物质而形成晚期核内体或称多泡小体，然后这些多泡小体会转运至细胞膜或经溶酶体途径降解，多泡小体与细胞膜融合，最后释放出里面的小囊泡，即为外泌体[13]。

释放至细胞外的外泌体通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞。外泌体与靶细胞有3 种作用方式：①外泌体可直接与细胞膜融合；②外泌体通过细胞膜表面的受体识别进入细胞内；③外泌体能被靶细胞内吞进入胞内[14]。与靶细胞作用后，外泌体还可通过释放自身的活性物质将信息传递给靶细胞，从而介导细胞间的信息交流，调控靶细胞的生理过程。

1.2.2 外泌体生物学功能 外泌体行使的生物学功能和其本身所含的蛋白质、mRNA、miRNA 及周围的微环境有关，作用于靶细胞后释放内容物激活胞内相关信号通路，进而调控细胞的功能和生物学行为[15，16]，如细胞凋亡、血管生成、再生修复、炎症反应和免疫应答等[17]。此外，外泌体可作为miRNA的运载体，在细胞间传递miRNA，miRNA 可降解靶细胞内mRNA 而引发mRNA 沉默，调控目的蛋白的表达[18]。基于外泌体可运载活性物质这一特性，最新研究还发现外泌体可以作为药物载体，将药物包裹并且靶向传递至靶细胞，用来替代某些易水解的药物，提高疗效[19]。外泌体的这些生物学功能在很大程度上有助于各种疾病的治疗。

2 骨髓间充质干细胞来源外泌体在疾病诊治中的应用

2.1 在呼吸系统疾病中的应用急性肺损伤（ALI）是常见的肺部疾病，可导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，肺泡及肺间质弥漫性水肿，严重时还会导致急性呼吸窘迫综合征[20，21]，造成较大的社会经济负担，已有研究证实BMSCs 治疗急性肺损伤的动物模型具有一定疗效[22]。ALI 是引起多器官功能障碍的主要原因，Liu 等[23]通过阻断大鼠肠系膜上动脉建立肠缺血再灌注（IIR）模型，发现静脉注射BMSCs-Exo 后能通过减少肺细胞凋亡和下调TLR4 受体的表达以及抑制NF-κB 通路的激活来减弱IIR 引起的肺损伤，说明BMSCs-Exo 可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路调控炎症损伤从而发挥肺保护作用，提示了IIR 介导的ALI 的外泌体治疗方法是一种新的潜在策略。Phinney 等[24]发现BMSCs 不仅能通过细胞外囊泡（EVs）运输线粒体调控巨噬细胞活性和肺组织功能，而且携带miR-451 的EVs 可使巨噬细胞对摄入的线粒体失去敏感性，减轻实验性矽尘诱导肺纤维化的损伤。说明外泌体自身所含的miRNA 也参与BMSCs-Exo在疾病中的应用。Zhang 等[25]证实在缺氧环境中BMSCs-Exo 能被邻近癌细胞吸收，促进癌细胞侵袭，这与外泌体自身的miRNA 相关，Exo介导miR-193a-3p、miR-210-3p 和miR-5100 转移可通过激活STAT3 信号通路促进肺癌细胞侵袭，这些外泌体携带的miRNA 有望成为无创肿瘤进展的生物标志物。

2.2 在循环系统疾病中的应用缺血性心肌梗死会导致心肌细胞坏死和瘢痕形成，进而影响心脏的功能。虽然目前有方法能在一定程度上改善心肌梗死后的心脏功能，但却不能替换已坏死的心肌细胞[26]。Teng 等[27]研究发现BMSCs-Exo 显著诱导脐静脉内皮细胞的增殖迁移，可损伤T 细胞功能，缩小梗死面积，保持心脏收缩和舒张功能，显著提高新功能毛细血管的密度，促进血流恢复，说明BMSCs-Exo能促进血管再生，抑制炎症反应，从而改善缺血性损伤后的心脏功能。Bian 等[28]也发现BMSCs-Exo能够改善心肌损伤，在低氧的刺激下BMSCs 能分泌大量的EVs，并且在大鼠心肌内注射EVs 能显著提高血流恢复的速度，减小梗死面积以及维持心脏的收缩和舒张功能。心肌缺血再灌注损伤（I/R）是指心肌组织发生缺血后，通过治疗恢复血液供应引起心肌细胞凋亡、坏死甚至导致心跳骤停的发生[29]。Chen 等[30]用结扎左前降支冠状动脉的方法建立大鼠I/R 模型探讨BMSCs-Exo 携带的miR-125b 对I/R 大鼠的影响，结果发现miR-125b 在I/R 心肌组织和细胞中表达下调，而注射携带miR-125b 的BMSCs-Exo 可显著提高细胞存活率，降低凋亡率，减轻I/R 大鼠心肌组织的病理损伤，表明BMSCs 衍生的携带miR-125b 的外泌体可保护心肌I/R。

2.3 在消化系统疾病中的应用肝脏作为各种物质代谢、能量转换的枢纽器官，其损伤修复是重点研究的内容。研究表明，MSCs-EVs 可以减少小鼠肝细胞损伤，促进肝细胞增殖，从而发挥保护作用[31]。而BMSCs-Exo 同样在消化系统疾病中发挥重要作用。急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）是由多种因素引起的肝细胞坏死或肝功能障碍的临床综合征[32]。Zhao 等[33]通过建立D-半乳糖胺和脂多糖诱导的肝细胞损伤和凋亡模型，发现经BMSCs-Exo处理后，促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 的裂解表达水平都明显降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平上调，表明BMSCs-Exo 具有降低急性肝衰竭后肝细胞凋亡的作用，尤其是发现BMSCs-Exo 通过促进自噬来减少肝细胞凋亡。Pan 等[34]在进行体外实验时指出骨髓间充质干细胞条件培养液可促进肝细胞的分化，能明显阻止由H2O2介导的肝细胞凋亡。王如岭等[35]发现小鼠移植BMSCs 来源的外泌体后，肝纤维化得到了一定程度的改善，说明BMSCs-Exo 对小鼠肝纤维化具有一定的治疗和预防作用，但具体作用机制有待进一步研究。溃疡性结肠炎临床症状多样，多反复发作，给多数患者的生活带来了很大困扰。Yang 等[36]发现在结肠炎模型中注 射BMSCs-EVs 后发现NF-κBp65、TNF-α 和IL-1β 等促炎细胞因子水平下降，观察到疾病活动度指数和组织学结肠损伤有所降低，指出BMSCs-EVs 可在一定程度上逆转实验性结肠炎。

2.4 在运动系统疾病中的应用近年研究发现BMSCs-Exo 在促进成骨分化、骨与软骨再生过程中起着重要作用，也可有效改善骨质疏松症状。Qin 等[37]为探讨BMSCs-EVs 在调节成骨细胞活性和骨再生中的作用，通过体内和体外实验发现EVs 在体外对成骨基因和成骨细胞分化有正向调节作用，但对成骨细胞增殖无抑制作用；此外，还发现BMSCs-EVs 在临界大小的颅骨骨缺损处导致更多的新骨形成。Zhang 等[38]通过股骨骨折大鼠模型实验，发现移植注射BMSCs-Exo 可促进骨生成和血管生成，从而促进骨折愈合，这种促进作用可能归因于激活BMP-2/Smad1/RUNX2 和HIF-1α/VEGF 信号通路。同样，Furuta 等[39]通过建立CD9-/-小鼠股骨骨折愈合模型，发现小鼠的骨折愈合缓慢，通过注射BMSCs-Exo 能够促进软骨内成骨，加速在条件培养基中骨折愈合，而注射缺乏外泌体的条件培养基则未出现这种情况，说明外泌体可作为促进组织修复的一种新信号因子。骨质疏松症（osteoporosis，OP） 是最常见的骨骼疾病，易发生骨折，严重威胁中老年人的健康[40]。叶庆元等[41]发现外泌体携带的miRNA 与维持机体骨量代谢平衡的相关激素密切相关。小鼠体内注射BMSCs-Exo，发现外泌体可通过转运 miR-26，恢复雌激素缺乏导致的骨质疏松模型小鼠的成骨分化功能并缓解骨质疏松，有望成为未来治疗骨质疏松的重要方法。

2.5 在神经系统疾病中的应用脑损伤与脑卒中是神经系统常见的疾病，其中脑卒中具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点，是危害社会健康的严重疾病[42]，但目前的治疗手段效果不明显。Zhang 等[43]为探讨人骨髓间充质干细胞来源外泌体（hBMSCs-Exo）改善实验性脑损伤（TBI）后的功能，通过Wistar 大鼠经皮质控制撞击建立TBI 模型，尾静脉注射hBMSCs-Exo，发现hBMSCs-Exo 通过促进内源性血管生成和神经生成，减少神经炎症，在一定程度上显著改善了TBI 后大鼠的功能恢复。Xiong 等[44]采用血管内穿孔法建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型，发现股静脉注射Exo 能改善SAH 后的神经功能，降低脑含水量，维持血脑屏障的完整性；同时也发现BMSCs-Exo 可通过释放miRNA129-5p抑制HMGB1-TLR4 通路的活性，发挥抗炎、抗凋亡作用，减轻SAH 后的早期脑损伤。Zhao 等[45]指出过表达microRNA-25 的BMSCs-Exo 可降低脊髓缺血模型大鼠的IL-1β 和TNF-α 水平，增加脊髓中的超氧化物歧化酶活性，保护存活的神经元，证实外泌体可通过microRNA-25 增强BMSCs 对缺血性脊髓治疗的神经保护作用。

2.6 在其他系统疾病中的应用来自骨髓间充质干细胞的外泌体已经应用于呼吸系统、循环系统、消化系统、运动系统和神经系统疾病中。随着近几年对间充质干细胞的大量研究，BMSCs-Exo 在其他疾病中也有广泛应用。在泌尿系统疾病中，Wang等[46]研究发现通过BMSCs-Exo 干预可使大鼠缺血再灌注肾脏损伤模型血清肌酐、BUN 水平降低，改善肾脏病理损伤，减少凋亡细胞数量，使炎性因子及Caspase-3 表达降低。在生殖系统疾病中，周政等[47]发现经BMSCs-Exo 治疗后，大鼠血清中E2上升、FSH 水平下降，接近正常水平，各级卵泡数目均明显增加，与模型组比较差异显著；说明BMSCs-Exo 可通过调节血清中各激素含量，促进卵泡发育，修复卵巢功能。在乳腺疾病中，王丹丹等[48]发现小鼠乳腺癌细胞通过注射BMSCs-Exo 能够增加其增殖、迁移及侵袭能力，其机制可能与上调 PI3K/Akt信号通路有关。目前BMSCs-Exo 应用于多个系统疾病的研究，为今后临床药物的研究与应用提供了新的思路。

3 小结

外泌体具有稳定的双分子磷脂结构，能保护其自身携带的DNA 片段、miRNA、mRNA 及功能性蛋白等活性物质，通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，与靶细胞作用后，外泌体通过释放内容物将信息传递给靶细胞，在细胞间的信息传递过程中起着重要作用，调控细胞生物学行为。外泌体携带的miRNA，可在细胞间传递，能够促进BMSCs-Exo在某些疾病中的作用。虽然目前BMSCs-Exo 在动物模型中可应用于多个系统疾病，减轻炎症反应及细胞损伤，也可作为药物载体，具有一定的应用前景，为疾病的治疗和预防提供了坚实的基础，但也存在许多难题，如如何高效大量地提取外泌体、如何保存以确保其活性、如何确定最适使用浓度以及如何将药物包埋入外泌体而不被分解等。目前对BMSCs-Exo 的研究还处于初期阶段，其作用于靶细胞的具体机制仍不明确，有待于进一步研究。