湖南剁辣椒降解亚硝酸盐乳酸菌筛选鉴定及发酵特性研究

卿煜维，杨剑，赵玲艳，邓放明

1(湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙，410128) 2(湖南农业大学，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙，410128)

剁辣椒是湖南地区的一种特色美食，自然发酵剁辣椒主要是利用辣椒表面天然附着的乳酸菌进行发酵，使其具有酸、香、辣的特点[1]。目前工业化生产剁辣椒普遍采用高盐腌制辣椒的加工方法,产品缺少传统发酵剁辣椒特有的风味,而且加工前要脱盐处理,对环境造成严重污染[2]。韩俊燕等[3]研究发现，自然发酵剁辣椒中以魏斯氏菌、明串珠菌和乳杆菌为主要发酵菌。叶陵等[4]研究发现，在发酵过程中接种发酵能使乳酸菌迅速增值,较快地降低剁辣椒的pH值，抑制致病菌的生长。因此,乳酸菌接种发酵剁辣椒成为剁辣椒产业发展的热点问题。

在发酵肉制品生产过程中硝酸盐和亚硝酸盐是一种重要的食品添加剂，可以有效抑制肉毒杆菌的生长[5]。果蔬发酵中，发酵初期体系pH值较高，硝酸盐还原菌大量繁殖，使蔬菜中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，生成亚硝峰[6]。翟磊等[7]研究发现，随着辣椒发酵时间的增加,亚硝酸盐的含量呈现先增加后减少的趋势,发酵第2天亚硝酸盐的含量达到峰值,自然发酵辣椒中亚硝酸盐含量为6.5 mg/kg。李罗明等[8]研究发现，发酵辣椒pH达到4时，接种发酵样品亚硝酸盐含量小于1 mg/kg自然发酵辣椒亚硝酸盐含量为15 mg/kg。亚硝酸盐含量超过安全范围可能会对人体造成危害,短期过量摄入会造成多种疾病,如高铁血红蛋白症、婴儿先天畸形[9-10]等。人体长期摄入亚硝酸盐也会产生一系列健康风险，过量的亚硝酸盐能够与食物中的生物胺相互作用，在消化道中转化为亚硝胺，具有强致癌作用[10]。

乳酸菌是发酵糖产生乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[11]，许多研究表明乳酸菌在食品发酵过程中具有很好的降亚硝酸盐作用。乳酸菌代谢产物亚硝酸还原酶和乳酸，可降解和清除亚硝酸盐，抑制硝酸盐还原菌的生长[12]。李罗明等[13]研究发现发酵辣椒pH值达到4时，自然发酵辣椒亚硝酸盐含量为15 mg/kg，而接种发酵样品亚硝酸盐含量小于1 mg/kg。目前乳酸菌降解亚硝酸酸盐研究主要集中在植物乳杆菌[14]、短乳杆菌[15]、发酵乳杆菌[16]、鼠李糖乳杆菌[17]等。张兴吉等[18]从西部传统发酵乳品中筛选出8株降解亚硝酸盐优势菌株，其中植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、短乳杆菌显示出稳定高效的亚硝酸盐降解能力。迟雪梅等[19]对常见乳酸菌降解亚硝酸盐发酵性能评价发现，副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌具有高效降解亚硝酸盐的能力,其中副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌在酶降解阶段能力较强,但由于该菌产酸较快,使其迅速进入酸降解阶段,而抑制亚硝酸盐降解速率;由于短乳杆菌异型发酵，产酸能力较弱，pH维持较高水平，亚硝酸盐还原酶能持续快速分解亚硝酸盐。

本研究主要从湖南地区发酵剁辣椒中选育生长、产酸速率快，具有亚硝酸盐降解能力的优良乳酸菌并对筛选菌株进行鉴定。研究乳酸菌生长曲线、产酸速率、降低亚硝酸盐能力、糖酵解等生物学特性，为日后将其应用于发酵辣椒工业化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 辣椒样品

在湖南长沙、岳阳、浏阳、娄底4个地区，采集12份传统发酵剁辣椒。采用无菌金属药勺取样，并放入灭菌后的100 mL离心管内，密封存放于低温采样箱中，24 h内送回试验室。

1.1.2 试剂

亚硝酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、硼酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、NaCl、HCl，国药集团化学试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒、生理生化鉴定管，北京陆桥技术有限公司；MC培养基，广州环凯微生物科技有限公司；MRS培养基，青岛海博生物科技有限公司。

1.2 仪器

ULTS1368医用低温冰箱，赛默飞世尔仪器有限公司；SPL-250生化培养箱，莱玻特仪器设备有限公司；HCB-1300V洁净工作台，海尔生物医药有限公司；PHS-2F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1801紫外/可见分光光度计，北分瑞利分析仪器有限责任公司；BIOFLO®120发酵罐，Eppendorf有限公司;SX-4-10型箱式电阻炉，天津泰斯特仪器有限公司；Olympus BH-2光学显微镜，奥林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离与纯化

分别称取12份剁辣椒样品各10 g,使用匀浆机匀浆，在无菌条件下加入90 mL无菌生理盐水,4 ℃保存备用。将上述样品稀释液稀释103倍后，取0.2 mL涂布于MC固体培养基中,装入厌氧袋于37 ℃条件下厌氧培养48 h后,挑取具有溶钙圈的单菌落，在MRS琼脂培养基上重复分离纯化3次，挑取单个菌落进行革兰氏染色与过氧化氢酶试验，革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性则初步鉴定为乳酸菌。将分离纯化后菌株置于MRS液体培养基中连续传代2代后加入20%甘油,放入-80 ℃冰箱进行保藏并编号。

1.3.2 降解亚硝酸盐乳酸菌初筛

1.3.2.1 菌株培养

将菌种接种到MRS液体培养基中传代活化3次。活化后的菌种按1%接种量接种到添加了250 mg/L亚硝酸钠的MRS培养基中,37 ℃培养24 h。

1.3.2.2 亚硝酸盐测定方法

参照文献[20-21]测定乳酸菌降解亚硝酸盐的方法并进行改良。菌株振荡培养24 h后,取0.1 mL菌液置于10 mL离心管中,依次加入0.5 mL饱和硼砂溶液、0.2 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液、0.2 mL 220 g/L乙酸锌溶液,然后加入9 mL超纯水,混匀,于4 000×g离心10 min。取5 mL上清液加入10 mL比色管中,加入1 mL对氨基苯磺酸溶液,摇匀,避光静置5 min,再加入0.5 mL 盐酸萘乙二胺溶液,超纯水定容至10 mL,摇匀,避光静置10 min。于538 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线并计算亚硝酸盐含量。

1.3.3 菌种鉴定

1.3.3.1 生理生化鉴定

生理生化试验包括过氧化氢酶试验、硫化氢试验、吲哚试验、葡萄糖产气试验、糖发酵试验、产黏性试验、VP试验、硝酸盐还原试验。参照《伯杰细菌鉴定手册》[22]与《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[23]对菌株进行初步鉴定。

1.3.3.2 分子生物学鉴定

挑取在MRS固体培养基上纯化后的乳酸菌菌落，采用DNA提取试剂盒提取DNA，并对菌株的16S rDNA进行PCR扩增。上游引物 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物 1495R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增条件：98℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸4 min。PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海派森诺生物工程有限公司进行测序。将测定的序列用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank数据库中与已知细菌的16S rRNA基因片段序列进行比较，确定菌种种属地位。然后从GenBank数据库中，下载已知乳酸菌属标准菌株的16S rRNA基因序列，应用MEGA 7.0软件,采用Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.3.4 生长曲线测定

将菌种接种到MRS液体培养基中传代活化3次。活化后的菌种按1%接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，每隔2 h测定其OD600值，每个菌株重复3次实验。

1.3.5 产酸能力的测定

将菌种接种到MRS液体培养基中传代活化3次。活化后的菌种按1%接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h,每隔2 h测定其pH值，每个菌株重复3次实验。

1.3.6 亚硝酸盐降解速率测定

将菌种接种到MRS液体培养基中传代活化3次。活化后的菌种按1%接种量接种到亚硝酸盐液体培养基中，37 ℃培养72 h,每隔24 h测定其亚硝酸盐含量，每个菌株重复3次试验。

1.3.7 发酵罐恒定pH发酵降解亚硝酸盐试验

将菌种接种到MRS液体培养基中传代活化3次。活化后的菌种按1%接种量接种到发酵罐中，用浓度为2 mol/L NaOH溶液调节pH，使其恒定pH值为6.0。在37 ℃条件下培养24 h,每隔4 h取样，测定亚硝酸盐含量，并与空白组及对照组进行对比。空白组：调节MRS液体培养基初始pH为6.0，不接种乳酸菌。对照组：调节MRS液体培养基初始pH为6.0，按1%接种量接种乳酸菌，但不调节pH。

1.3.8 数据统计与分析

所有实验均重复3次,然后利用SPSS 20进行显著性分析、Excel 2018计算平均值和标准差、Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离结果

经MC琼脂培养基涂布分离、革兰氏染色、过氧化氢酶试验，共分离得到革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性、有溶钙圈的乳酸菌33株。其中长沙地区分离出6株，编号为Z1-1～Z1-6。娄底地区分离出9株，编号为X14-1～X14-9。浏阳地区分离出15株，编号为L13-1～L13-15。岳阳地区分离出2株，编号为H3D与H3X。

2.2 降解亚硝酸盐乳酸菌初筛

将纯化后的33株乳酸菌菌株传代活化3次,加入含250 mg/L NaNO2的MRS培养基中培养,37 ℃培养24 h后测定亚硝酸盐降低情况。如图1所示,乳酸菌X14-7、Z1-6、L13-13、H3D亚硝酸盐降低率较强，分别为87.7%、80.9%、86.3%和79.3%。所以选择降解亚硝酸盐能力最强的4株乳酸菌进行后续试验。

2.3 筛选乳酸菌形态学鉴定

菌株H3D菌落形态为圆形、凸起、乳白色不透明状，菌株X14-7菌落形态为圆形、凹起、灰白色透明状，菌株Z1-6菌落形态为圆形、扁平、乳白色不透明状，菌株L13-13菌落形态为圆形、凸起、乳白色不透明状。四株乳酸菌革兰氏染色镜检细胞形态结果见图2。

2.4 乳酸菌生理生化鉴定

生理生化鉴定结果显示:4株分离株均不能使明胶液化、不产H2S、不能水解淀粉；吲哚试验、VP试验、硝酸盐还原试验均为阴性。综上,可初步判定4株菌为乳杆菌属。对其进行糖发酵实验、产黏试验以及葡萄糖产气试验，结果见表1。经鉴定H3D为植物乳杆菌，X14-7为德氏乳杆菌，Z1-6为短乳杆菌，L13-13为戊糖乳杆菌。

注:“+”代表反应为阳性,“-”代表反应为阴性

2.5 筛选乳酸菌16S rDNA基因序列分析

将纯化后的乳酸菌低温送至派森诺生物科技公司提取基因组，以通用引物对 (27F/1492R) 对菌株16S rDNA序列进行扩增。PCR扩增产物经纯化，检验合格后进行测序。测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST比对,采用MEGA7软件中的邻接法 (neighbour-joining,NJ) 构建系统发育树(图3)。

结果发现，菌株H3D与植物乳杆菌L.plantarumJCM 1149(登录号:NR_115605.1)相似性为99%；菌株Z1-6与短乳杆菌L.brevisATCC 14869 (登录号:NR_044704.2)相似性为99%；菌株X14-7与德氏乳杆菌L.delbrueckiiATCC 9649 (登录号:NR_115132.1)相似性为99%；菌株L13-13与戊糖乳杆菌L.pentosus124-2 (登录号:CP026743.1)相似性为100%。菌株H3D、L13-13与植物乳杆菌、戊糖乳杆菌位于一个分支,但H3D与植物乳杆菌亲缘性更近，单独位于一个小分支;菌株Z1-6与短乳杆菌亲缘关系最近；菌株X14-7与德氏乳杆菌亲缘关系最近;结合生理生化鉴定结果，进一步确定菌株H3D为植物乳杆菌，Z1-6为短乳杆菌，X14-7为德氏乳杆菌，L13-13为戊糖乳杆菌。

2.6 筛选乳酸菌生长曲线测定

由图4和图5可知,乳酸菌H3D、X14-7、L13-13培养2 h后进入对数生长期,12 h时进入稳定期；乳酸菌Z1-6在培养2 h后进入对数期，20 h时进入稳定期；乳酸菌pH值随时间增加逐渐减小。其中乳酸菌L13-13的产酸能力最强,发酵液的pH值可达3.49；乳酸菌X14-7产酸速率最快，发酵12 h其pH下降至4.12，可有效抑制腐败菌的生长。

由此可知,在低盐发酵蔬菜生产中,乳酸菌X14-7具有作为直投式发酵菌种的潜力。乳酸菌Z1-6由于其生长速率与产酸较慢，同时生理生化鉴定葡萄糖发酵产气试验为阳性，可推断乳酸菌Z1-6为异性发酵乳酸菌，可在果蔬发酵过程中产生大量CO2抑制好氧菌的生长。

2.7 筛选乳酸菌亚硝酸盐降解速率测定

研究发现乳酸菌降解亚硝酸盐分为2个阶段，发酵前期以酶降解为主，发酵后期pH小于4时以酸降解为主[24-25]。由图6可知,发酵期间各菌株亚硝酸盐培养基中硝酸盐残留量逐渐降低。发酵前4 h亚硝酸盐降解速率较慢,此时乳酸菌处于迟缓期，培养基中乳酸菌数量与酸浓度都较低。发酵4～12 h亚硝酸盐降解速率加快，此时乳酸菌进入生长对数期，培养基pH值大于4，亚硝酸盐以酶降解为主，乳酸菌H3D、X14-7、Z1-6、L13-13降解率分别为48.9%、74.4%、58.5%、48.9%。发酵12 h后pH值下降到4以下，此时以酸降解为主，亚硝酸盐降解速率降低，其原因可能是亚硝酸盐浓度降低同时较低的pH抑制亚硝酸盐还原酶的活性[26]。发酵72 h时，培养基中亚硝酸盐残留量分别为9.7%、1.5%、16.1%、7.7%。实验结果表明，乳酸菌X14-7前12 h亚硝酸盐降解率显著高于其余3株乳酸菌且发酵72 h亚硝酸盐残留最少。因此,选择菌株X14-7作为后续试验所用菌。

2.8 X14-7乳酸菌发酵罐恒定pH值降解亚硝酸盐速率

由图7可知，37 ℃培养24 h，空白组培养基中亚硝酸盐含量基本维持不变，实验组在发酵罐中维持pH 为6.0，消除了酸对亚硝酸盐的降解作用后,降解速率显著高于正常发酵组(P<0.05),发酵24 h后亚硝酸盐残留量仅为1.1%，其原因可能是乳酸菌在pH为6.0时最大菌密度高于正常发酵组且亚硝酸盐降解酶未受到酸性条件的抑制。

由此可推测X14-7对亚硝酸盐的降解不只是酸降解的作用,还可能存在其他亚硝酸盐降解途径,包括异硝化作用与酶降解等。

3 结论与讨论

发酵剁辣椒是湖南地区十分受欢迎的食品，也是乳酸菌菌种重要来源之一。赵玲艳等[27]研究发现发酵剁辣椒中存在植物乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌、戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌、短乳杆菌等数十种乳酸菌。因此，对发酵辣椒中优良菌种进行筛选具有重要意义。本研究从湖南长沙、岳阳、浏阳、娄底4个地区采集12份传统发酵剁辣椒，共分离出33株乳酸菌,通过对亚硝酸盐降解能力初筛,形态观察、生理生化鉴定及分子生物学技术,最后鉴定菌株H3D、X14-7、Z136、L13-13分别为植物乳杆菌、德氏乳杆菌、短乳杆菌、戊糖乳杆菌。

亚硝酸盐是一种在发酵食品中常见有害物质，对人体健康具有潜在危害。研究发现乳酸菌能通过产生乳酸或亚硝酸盐还原酶抑制亚硝酸盐的形成。张庆芳等[24]认为乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为NiR降解和酸降解2个阶段。p H>4.5时,乳酸菌对亚硝酸盐降解以酶降解为主；pH<4.0后,亚硝酸盐的降解主要以酸降解为主。但发酵蔬菜形成亚硝峰的时间主要在发酵前期，因此选育出高效酶降解亚硝酸盐的乳酸菌对保障发酵蔬菜食品安全十分重要。本实验中菌株X14-7具有很强的亚硝酸盐降解能力,发酵24 h亚硝酸盐降解率为87.7%。发酵罐恒定发酵试验表明菌株X14-7在pH 6.0的条件下发酵24 h其亚硝酸盐降解率为98.9%，这一现象表明乳酸菌X14-7降解亚硝酸盐的途径可能包含除酸降解以外的其他途径，而乳酸菌酶降解研究主要集中在短乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。目前研究尚未报道德氏乳杆菌具有亚硝酸还原酶基因，因此德氏乳杆菌酶降解代谢通路需进一步确认。同时乳酸菌X14-7迟缓期短，生长速率、产酸速率、亚硝酸盐降解快，能有效抑制发酵蔬菜发酵前期腐败菌的生长以及亚硝酸盐含量，提高发酵蔬菜食品安全性，具有较大的开发潜力。