高迁移率族蛋白1在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究进展

陈川斌，黄锋

心血管狭窄或闭塞可导致心肌缺血事件发生，严重而持久的心肌缺血易发展成不可逆的心肌梗死，及时恢复冠状动脉血液灌注是挽救濒死心肌的关键，其主要措施有经皮冠状动脉介入治疗、溶栓和冠脉搭桥术［1］。通过再灌注治疗，心肌得以恢复氧及营养物质的供应，但同时加重了心肌组织进一步损伤，即心肌缺血再灌注损伤［2］。心肌缺血再灌注损伤涉及多种复杂的病理机制，研究证明其与钙超载、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和自噬等密切相关［2-4］。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一种非组蛋白的染色体结合蛋白，普遍存在于真核细胞的胞核内，在基因复制、转录和修复过程中有重要作用［5］。HMGB1的作用在心肌发生缺血再灌注时产生了极大转变。Andrassy等［6］首次阐述了HMGB1在心肌缺血再灌注损伤中是一种“危险分子”。其在心肌缺血再灌注损伤中的作用较为广泛且复杂。本文就HMGB1在心肌缺血再灌注损伤中的病理机制进行综述。

1 HMGB1概述

1.1 HMGB1结构、功能和生物活性HMGB1由215个氨基酸残基构成，包含2个同源结构域，其中B盒是炎性功能区，A盒具有拮抗B盒作用［7］。根据A盒第23、45位点的半胱氨酸残基（C23、C45）和B盒第106位点的半胱氨酸残基（C106）氧化还原修饰不同，HMGB1分为3种类型，包括完全还原型HMGB1（fully reduced HMGB1，fr-HMGB1）、二硫键型HMGB1（disulfide HMGB1，ds-HMGB1）和氧化型HMGB1（oxidized HMGB1，ox-HMGB1），其 中fr-HMGB1和ds-HMGB1的生物活性较为广泛。生理条件下，胞核内fr-HMGB1维持核小体结构、基因转录和DNA损伤修复。受刺激因素影响，fr-HMGB1向核外易位，发生氧化形成ds-HMGB1。两者广泛参与机体免疫应答、细胞迁移和增殖分化等过程［7-8］。

1.2 HMGB1相关受体和通路

1.2.1 晚期糖基化终末产物受体（RAGE）RAGE是一种多配体跨膜蛋白，包含3个不同片段，其中胞外段V型结构域可识别晚期糖基化终末产物、HMGB1、S100/钙粒蛋白和β淀粉样肽等配体，胞内段经丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，激活核转录因子-κB（NF-κB）［9］。

1.2.2 Toll样受体（TLRs）TLRs是一类跨膜受体蛋白，通过识别病原体相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）或损伤相关分子 模 式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活天然免疫系统［10］。TLRs由胞外段、跨膜段和胞内段构成，其中胞外段重复亮氨酸结构域（LRR）可识别HMGB1配体，胞内段的Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域经髓样分化因子88（MyD88）途径，或β-干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）途径，均可激活NF-κB［11］。

1.2.3 NF-κB信号通路生理条件下，NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）与细胞核表面NF-κB结合紧密，有效阻止NF-κB向细胞核内易位。受刺激因素影响，胞外HMGB1与RAGE或TLRs受体结合，促使IκB激酶β（IKK-β）磷酸化修饰IκB-α，导致IκB-α降解，NFκB脱离IκB-α；游离的NF-κB易位至核内编码炎性基因，诱导细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-8及HMGB1等多种促炎因子，形成一种正反馈促炎环路［12-13］。

2 HMGB1参与心肌缺血再灌注损伤的病理机制

在心肌缺血再灌注中，HMGB1主要由损伤或坏死心肌细胞被动释放和（或）浸润中性粒细胞、单核/巨噬细胞等免疫细胞主动分泌［6］，而较少由内皮细胞或成纤维细胞释放［14］。研究发现，损伤心肌组织中HMGB1随缺血时间延长而增加［15］，再灌注7 d后增加仍较为明显［6］。血循环中HMGB1在心肌缺血40 min仍未见明显增加，而在再灌注5 min后迅速增加［15］，30 min后增加更为显著［10］。心肌缺血再灌注后释放的HMGB1参与包括炎症反应、细胞凋亡和自噬等机制，从而加重心肌损伤。

2.1 炎症反应

2.1.1 中性粒细胞HMGB1在缺血再灌注心肌组织中对脾源性中性粒细胞的趋化显著［16］。再灌注后，释放入血中的HMGB1和游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）明显增多，HMGB1可能与脾细胞膜受体RAGE结合，促使cfDNA渗入胞内（具体机制尚不明确），入胞后cfDNA与TLR9结合，释放促炎信号，诱导脾区的中性粒细胞向受损心肌组织迁移，又进一步促进HMGB1释放，产生炎症级联反应。研究表明，抑制HMGB1或cfDNA释放入血，均能够有效减轻心肌缺血再灌注损伤［15］。再者，敲除小鼠脾细胞RAGE基因，也可减弱再灌注后HMGB1诱导的脾源性中性粒细胞趋化作用［16］。

2.1.2 单核/巨噬细胞Fujiwara等［10］推测，相较中性粒细胞，单核/巨噬细胞趋化在心肌缺血再灌注损伤中可能起更为主要的作用，但尚未见报道HMGB1能诱导单核/巨噬细胞趋化。Andrassy等［6］利用外源性HMGB1诱导正常巨噬细胞，可促使细胞分泌IL-6和TNF-α，而这一干预在RAGE基因缺陷的巨噬细胞中无明显变化。因此，再灌注后释放的HMGB1可能与单核/巨噬细胞RAGE受体结合，诱导单核/巨噬细胞释放炎性因子。HMGB1能否与单核/巨噬细胞的TLRs受体结合参与炎症反应尚未清楚，但Fujiwara等［10］采用纳米颗粒技术，通过靶向拮抗小鼠体内的单核/巨噬细胞TLR4受体，可有效抑制心肌缺血再灌注后HMGB1释放及NF-κB通路激活，减轻心肌组织炎症损伤。

2.1.3 树突状细胞Xue等［17］发现，心肌缺血再灌注后释放的HMGB1与树突状细胞TLR4受体结合，经MyD88途径，可激活NF-κB通路，促使树突状细胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α等诸多炎性因子，还可诱导树突状细胞聚集，并迁移至受损心肌组织。相反，拮抗HMGB1活性，显著减弱了缺血再灌注后树突状细胞聚集、趋化和分泌炎性因子的作用。

2.2 细胞凋亡

2.2.1 c-jun氨基末端激酶（JNK）通路Andrassy等［6］利用外源性HMGB1诱导正常心肌细胞，并未有效激活JNK信号通路。之后研究发现，心肌细胞经缺氧/复氧处理后同时释放HMGB1和TNF-α，TNFα在HMGB1协同作用下，显著激活JNK信号通路，活化的JNK诱导胞内B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）易位至线粒体膜，改变膜上Bcl-2与Bax的比例，导致膜间隙释放细胞色素C，激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）级联反应，最终促使心肌细胞凋亡［18-19］。Zhai等［19］利用甘草甜素预处理小鼠，能够降低心肌缺血再灌注后HMGB1水平，抑制JNK信号通路的激活。因此，TNF-α/JNK凋亡信号通路可能部分依赖HMGB1调控。

2.2.2 受体相互作用蛋白（RIP）1/RIP3通路研究发现，心肌细胞进行缺氧/复氧后释放的HMGB1可能激活RIP1，活化的RIP1通过磷酸化修饰RIP3，两者形成RIP1-RIP3坏死复合体，促使下游混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）磷酸化，磷酸化的MLKL破坏了细胞内膜完整性，最终导致心肌细胞坏死性凋亡；随后，该研究通过沉默心肌细胞HMGB1表达，抑制缺氧/复氧后细胞内RIP1/RIP3/MLKL信号通路活化，细胞坏死性凋亡亦被抑制［20］。

2.2.3 其他研究发现，敲除心肌细胞膜受体TLR4基因，可抑制心肌缺血再灌注后HMGB1/TNF-α凋亡通路的激活［18］。此外，Herzog等［14］分别沉默心肌细胞中不同的膜受体TLR2、TLR4和RAGE表达，对比三者发现，沉默TLR2表达能够更显著地下调缺氧/复氧后心肌细胞中HMGB1介导的凋亡通路的激活。由此可见，HMGB1与缺氧/复氧的心肌细胞TLRs或RAGE受体结合或许存在部分相同凋亡信号通路，抑制HMGB1/TLR2通路激活可能发挥更广泛的抗凋亡作用。

2.3 自噬

2.3.1 胞核内研究显示，心肌细胞胞核内HMGB1可能通过激活转录因子调节功能，正向调控热休克蛋白B1（HSPB1）表达（具体机制尚未明确），两者均参与了Pink1/Parkin途径线粒体自噬过程。激活HMGB1/HSPB1信号通路不仅促进Parkin易位至线粒体外膜，上调电压依赖性阴离子通道蛋白1（VDAC1）泛素化水平，有利于自噬小体识别受损线粒体，还可促进自噬小体与溶酶体融合，维持自噬动态过程［21］。Yang等［22］对HACMs心肌细胞进行缺氧/复氧处理后，发现HMGB1/HSPB1信号通路明显受抑制。随后，该研究将pcDNA-HMGB1转染至心肌细胞内，通过过表达HMGB1上调HSPB1蛋白水平，激活缺氧/复氧的心肌细胞中HMGB1/HSPB1通路，可促进线粒体自噬过程，加速清除受损线粒体，改善ATP供给短缺。

2.3.2 胞核外生理条件下，分布在心肌细胞胞核外的HMGB1较少，受刺激因素影响，胞核内HMGB1可迁移到胞质及胞外。胞质中HMGB1通过直接竞争性分离Bcl-2/Beclin-1复合体，或者通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）信号通路，诱导Bcl-2磷酸化，间接促使Bcl-2和Beclin-1分离，游离的Beclin-1与HMGB1结合促进自噬小体形成［6，21］。胞外的HMGB1通过与RAGE受体结合，抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激活，促使Beclin1/Ptdlns3KC3复合体增多，从而诱发自噬［21］。Hu等［23］发现，心肌细胞进行缺氧/复氧后胞内的Bcl-2表达降低，而Beclin-1表达升高，伴随微管相关蛋白1轻链3（LC3）变化，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升和p62蛋白降解，自噬活性明显增强，这可能与细胞缺氧/复氧后释放的HMGB1有关。随后，该研究发现，使用HMGB1抗体预处理心肌细胞，减少细胞缺氧/复氧后释放的HMGB1，可抑制Beclin-1途径自噬激活。Su等［24］在心肌细胞中沉默HMGB1表达，也可降低经H2O2处理后的细胞内Beclin-1途径自噬水平，缓解细胞损伤。

2.4 内质网应激（ERS）有研究显示，HMGB1可能参与激活心肌缺血再灌注后ERS。该研究通过沉默大鼠心肌组织HMGB1表达，发现大鼠心肌缺血再灌注后几种ERS标志蛋白如糖调节蛋白78（GRP78）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）和caspase-12均受抑制［25］，但相关的信号通路尚未阐明。

3 心肌缺血再灌注损伤中HMGB1与其他小分子间的调控作用

3.1 非编码RNA

3.1.1 微小RNA（miRNA）近年研究证实，心肌缺血再灌注损伤中存在多个保护性miRNA靶向作用于HMGB1。Chen等［26］在体外研究中将miR-129-5p激动剂注入缺氧/复氧的心肌细胞中，发现表达增多的miR-129-5p可抑制HMGB1表达，进而改善Bcl-2/Bax比例失衡，起到抗细胞凋亡作用；并且，在体内研究进一步验证miR-129-5p通过靶向抑制HMGB1发挥心肌保护作用。Su等［24］将miR-142-3p模拟物转染至心肌细胞后，发现表达增多的miR-142-3p可靶向抑制HMGB1，显著减少经H2O2处理的心肌细胞发生的细胞凋亡和自噬，从而有效挽救受损心肌细胞［24］。Li等［27］发现，丙泊酚能显著上调心肌缺血再灌注大鼠模型中miR-451的表达水平，表达增多的miR-451可通过靶向抑制HMGB1，产生抗细胞凋亡作用。Liu等［28］发现，过表达miR-25可通过靶向抑制HMGB1，有效地减少缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡的发生。Yao等［29］在给予慢病毒搭载pre-miR-26a转染小鼠预处理中发现，小鼠心脏供体有助于减轻心脏移植术后发生的心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与miR-26a靶向抑制HMGB1有关。

3.1.2 长链非编码RNA（lncRNA）Shi等［30］发现，心肌细胞缺氧缺糖/复氧后，lncRNA牛磺酸上调基因1（taurine upregulated gene-1，TUG1）表达上调，细胞凋亡水平增高，这可能与TUG1激活HMGB1有关。随后，进一步对心肌细胞TUG1沉默处理，结果显示抑制TUG1能够减少缺氧缺糖/复氧后HMGB1释放，改善线粒体膜上Bcl-2/Bax比例失衡，发挥抗细 胞 凋亡 作 用。Su等［24］发现，lncRNA TUG1为miR142-3p的“分子海绵”，心肌细胞进行H2O2处理后，TUG1减弱了miR142-3p对靶基因HMGB1的抑制作用，使HMGB1活性增强；相反，沉默心肌细胞内TUG1，再灌注后miR142-3p的表达增高，miR142-3p则通过靶向抑制HMGB1，减少心肌细胞凋亡和自噬。

3.2 蛋白和信号通路

3.2.1 拮抗蛋白Herzog等［14］对心肌细胞进行缺氧/复氧实验后发现，血栓调节蛋白（TM）的凝集素样结构域（LLD）能够竞争性结合HMGB1，在心肌细胞中转染含LLD的TM cDNA质粒，上调TM表达，能显著抑制再灌注后HMGB1/TLR2凋亡信号通路的激活。Ma等［31］利用二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂干预缺氧处理的H9C2心肌细胞，发现核因子E2相关因子（Nrf2）和血红素加氧酶1（HO-1）表达增高，而HMGB1表达降低。Ma等［32］在对大鼠行心肌缺血再灌注术前注射IL-33，发现IL-33可能通过与生长刺激表达基因2蛋白（ST2）结合，激活p38信号通路，抑制缺血再灌注后HMGB1和炎症因子的释放，从而发挥心肌保护作用。

3.2.2 胆碱能抗炎通路研究显示，激活迷走神经抗炎通路可抑制心肌缺血再灌注后HMGB1释放。右美托咪定预处理可通过兴奋迷走神经，促使乙酰胆碱（Ach）释放，结合N样受体（nAchR），尤其与α7nAchR结合，有效地抑制了缺血再灌注后释放的HMGB1与TLR4受体结合，从而下调经MyD88依赖途径所激活的NF-κB通路，减少IL-6和TNF-α释放［33-34］；反之，以阻断迷走神经兴奋或者拮抗Ach与α7nAchR结合的形式抑制胆碱能抗炎通路，均可导致再灌注后HMGB1释放增加，激活HMGB1/TLR4信号通路［33］。

3.2.3 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路PI3K/Akt信号通路在心肌缺血再灌注损伤中可发挥保护效应。研究表明，雷公藤红素预处理可通过激活PI3K/Akt信号通路，有效地减少心肌缺血再灌注后HMGB1释放，从而抑制Beclin-1自噬相关信号通路激活；相反，LY294002（PI3K抑制剂）阻遏了雷公藤红素的保护作用，导致再灌注后HMGB1释放增加［35］。另一项研究显示，丹酚酸B预处理也可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制HMGB1/TLR4途径的活化，有效地减少炎性因子释放及细胞凋亡发生，而LY294002预处理也同样减弱了丹酚酸B的保护作用［36］。

4 外源性HMGB1

4.1 预处理研究发现，在大鼠心肌缺血再灌注术前30 min予小剂量HMGB1（12.5～60 ng/只）处理，可减轻再灌注后心肌损伤，呈剂量依赖性增益效果［37］。这其中可能参与的信号通路包括激活PI3K/Akt信号通路和（或）抑制p38/MAPK信号通路，从而上调低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达，已证明HIF-1α对心肌缺血再灌注损伤有多种保护效应，包括改善能量代谢、抗细胞凋亡和抗氧化应激作用［38］；激活PI3K/Akt信号通路能通过上调血管内皮生长因子（VEGF）表达，减轻缺血再灌注后心肌间质纤维化，从而改善心功能［39］。术前24 h予大剂量HMGB1（50～60μg/只）处理，同样可激活PI3K/Akt信号通路，减轻再灌注后炎症损伤和氧化应激［40］。由此可见，外源性HMGB1并非单纯作为内源化补充，导致心肌缺血再灌注损伤。上述研究表明，时间和剂量可能是改善再灌注心肌损伤结局的关键因素。在可控的时间和剂量下，外源性HMGB1预处理不足以引起正常机体损伤，但其可被视为“危险信号”，使机体产生“警觉”，激活非特异免疫反应，产生一些“正在路上”的保护性因子，为心脏提供适应性和保护性应答。

4.2 后处理Abarbanell等［41］研究显示，在大鼠离体心脏的冠脉内注射HMGB1（200 ng）进行后处理能够减小再灌注后心肌梗死面积，有效改善心功能，但加大HMGB1剂量（1 000 ng）后处理减弱了上述作用。Lin等［42］在大鼠心肌缺血再灌注模型予中、小剂量HMGB1（0.22～2.5μg/只）后处理，发现心肌再灌注后心肌梗死面积和心功能无明显变化；同时，模型中注射大剂量HMGB1（22～25μg/只）进行后处理，心肌再灌注后引起炎症因子释放增多，最终导致损伤加重；然而，体内研究中，HMGB1后处理并未有效改善心肌损伤，这其中机制尚未清楚，推测与机体缺血事件发生后抑制了保护性信号通路激活或保护性因子释放有关，最终导致后处理时这些保护性因素无法有效应答外源性HMGB1的刺激信号；离体研究中，小剂量外源性HMGB1后处理可使再灌注后心肌损伤获益；与体内研究不同，离体切断了全身血液循环，这一局部干预对受损心肌组织的作用机制仍未阐明。

5 小结与展望

在心肌缺血再灌注损伤中，内源性HMGB1介导的炎性因子对心肌细胞造成炎症损伤，并且参与细胞凋亡和自噬调控心肌细胞的死亡进程。上述病理机制又增加HMGB1释放，形成恶性循环。通过拮抗内源性HMGB1可有效遏制各个病理过程。而外源性HMGB1除了作为内源性补充，还可能对心肌再灌注损伤起保护作用，选择合适的时间与剂量给予外源性HMGB1，可有效改善心肌再灌注损伤。干预HMGB1作用的制剂也很重要，HMGB1 A盒、单克隆抗HMGB1抗体等生物制剂尚未得到临床推广，药物研究显示雷公藤红素、丹酚酸B等具备抑制HMGB1作用。因此，应不断深入了解心肌缺血再灌注损伤中HMGB1所产生的作用，尽可能使干预HMGB1靶点发挥最大化效益。