蛋白翻译后修饰与肠易激综合征

王玥梅，朱远冰，吴巧凤，2，3△

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种胃肠道功能障碍性疾病，以反复腹痛、腹胀、粪便形态异常或排便规律改变等为主要临床表现［1］。IBS由多种因素引发，肠道反应性变化（包括运动功能和分泌功能异常）、肠道感染和菌群失调、内脏高敏感性、脑-肠轴功能紊乱、心理压力等因素可能与IBS有关或参与IBS的发病机制［2］。蛋白翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）是蛋白质功能调节的一种重要方式，指蛋白质在翻译后发生的化学变化，主要由识别特定蛋白质中特定靶序列的酶催化［3］，与许多重要的生命活动、疾病发生密切相关［4-5］。研究发现，人类细胞中的蛋白质存在不同类别的PTMs，在生理和病理条件下，PTMs能够影响蛋白的稳定性、活性、定位以及信号转导等不同方面，迅速调节细胞内生命活动，同时丰富蛋白功能的多样性［6-7］。多种PTMs如乙酰化、磷酸化、甲基化等通过对相关蛋白分子的修饰及通路的活化在调节IBS内脏超敏、肠黏膜屏障、肠道免疫细胞等方面起重要作用。深入探索PTMs与IBS的关系对明确该疾病发生机制、治疗靶标等方面均有重要意义。现就几种蛋白修饰类型及其在IBS中作用的研究进展概述如下。

1 乙酰化修饰与IBS

乙酰化修饰是将乙酰基转移到目标蛋白氨基酸侧链基团上的过程。蛋白乙酰化修饰主要发生在赖氨酸NH3

+基团上，作为一种可逆的PTMs，它通常由赖氨酸乙酰化酶（lysine acetyltransferase，KAT）和赖氨酸去乙酰化酶（lysine deacetyltransferase，KDAT）调控，目前研究显示组蛋白上的赖氨酸残基乙酰化修饰主要在染色质结构和核小体动力学的调节中起重要作用［8］。乙酰化修饰最先在组蛋白上被发现，两种催化酶也被称作组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）。在HAT或HDAC的催化下，乙酰基团可在组蛋白赖氨酸残基上添加或去除，分别增强或抑制DNA的转录水平。乙酰化修饰主要在核内或胞内发挥各自功能，在细胞生长、衰老、炎性反应等过程中发挥关键作用［9］。

研究发现，乙酰化修饰与IBS的相关性主要体现在内脏超敏性方面。内脏高敏感性是IBS重要发病因素，IBS患者中33%～90%表现为以痛觉过敏和异常性疼痛为特征的内脏超敏反应［10］。在反复应激或皮质酮水平改变诱导的内脏超敏反应中，通过改变大脑和脊髓中的组蛋白乙酰化水平，可导致促伤害性和抗伤害性基因表达产生特定变化，且HDAC抑制剂有可能成为IBS相关的内脏超敏反应症状的潜在治疗方法［11］。

组蛋白乙酰化修饰在杏仁核介导的应激性内脏超敏机制中有重要作用，这一作用与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）有密切关系。HPA轴在下丘脑启动，下视丘室旁核有可以进行神经内分泌的神经元，该神经元可合成并分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），作用于垂体前叶，促进促肾上腺皮质激素（ACTH）的释放。肾上腺皮质在ACTH的作用下合成糖皮质激素（主要是皮质醇）释放入循环后，皮质醇与糖皮质激素受体（GR）结合，作用于下丘脑和垂体（分别抑制CRH和ACTH的合成与分泌），形成反馈调节环路。相反，皮质醇与杏仁核GR的结合可促进HPA轴，从而导致持续的应激活化，不仅诱导内脏产生超敏反应，而且使GR启动子处组蛋白3的乙酰化水平下降［11］。GR启动子区域组蛋白乙酰化的降低导致杏仁核中央核（CeA）内GR表达减少，随后由于GR介导的抑制作用丧失，使CRH的表达增加［11］。而通过双侧CeA灌注HDAC抑制剂如三环素A或亚甲酰苯胺氢肟酸可减轻内脏超敏反应［12］。同时在IBS患者中发现，GR表达水平改变或杏仁核中CRH分泌的增加对杏仁核介导的HPA轴具有促进作用［13］。生命早期应激（early life stress，ELS）引起的新生儿内脏痛敏反应与CeA中CRH表达水平的增加密切相关［14］。Louwies等［15］发现ELS增加了成年雌性大鼠CeA中组蛋白3赖氨酸9（H3K9）乙酰化水平，CRH启动子上的H3K9乙酰化增加，GR结合减少。CeA中组蛋白乙酰化失调与CRH启动子GR结合失调是早期应激介导成年内脏痛敏的重要机制。因此ELS可能通过增加CRH启动子处的H3K9乙酰化水平，导致CeA中CRH的上调，从而导致内脏超敏反应。研究发现鞘内注射HDAC抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸可减轻应激引起的雌性大鼠内脏超敏反应，改善其排便情况［16］。有研究表明使用该抑制剂后可增加脊髓谷氨酸受体（glutamate receptors）mGluR2和mGluR3的表达，揭示组蛋白乙酰化修饰可调节脊髓中mGluR2/3的表达，以缓解应激诱发的内脏超敏反应［17-18］。此外，组蛋白去乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A经脑室给药可显著抑制成年大鼠多次避水胁迫后所致的IBS内脏超敏反应［19］。由此可见，乙酰化修饰在IBS疾病发生发展中有不可忽视的地位。

2 甲基化修饰与IBS

生物体中甲基化经甲基转移酶和去甲基化酶催化，共同参与形成和维系不同的甲基化状态，涉及基因表达调控、蛋白质功能调节及RNA加工等生命活动，与炎症、肿瘤、阿尔茨海默病等许多疾病发生发展紧密相关。常见的甲基化分类主要包括DNA甲基化和组蛋白甲基化，以及逐渐作为研究热点之一的RNA甲基化。组蛋白甲基化一般发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上，赖氨酸甲基化主要由包含SET结构域的甲基转移酶催化完成，常发生在组蛋白H3赖氨酸第4、9、27、36、79位残基（H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79）和组蛋白H4赖氨酸第20位残基（H4K20）。同时，H3K4、H3K36、H3K79的甲基化常与基因转录激活相关，而H3K9、H3K27、H4K20的甲基化与基因转录抑制作用相关［20］。精氨酸甲基化主要由蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）催化完成。Chen等［21］研究发现基因组某一启动子组蛋白H3第4位赖氨酸残基三甲基（H3K4me3）可增强基因转录，而同一组蛋白H3的第9和27位赖氨酸残基上三甲基化（H3K9me3和H3K27me3）抑制了基因的表达。在IBS甲基化全基因组分析研究中发现，和空白对照组相比，IBS模型组差异表达基因中Notch信号明显增强，黏着斑明显增加，并且在它们的启动子区域中共有541个基因的甲基化水平明显较低，而626个基因的甲基化水平明显较高［22］。Mahurkar等［23］检测IBS患者外周血单核细胞（PBMC）DNA甲基化水平，鉴定出133个差异性甲基化位点，类型主要与氧化应激和神经肽激素活性有关。同时研究人员通过测序验证了谷胱甘肽-s-转移酶mu5（GSTM5）和促进蛋白基因聚合的微管蛋白的甲基化水平差异性，且GSTM5中2个启动子CpG的甲基化与表观遗传沉默相关。由此可见，在IBS发生发展过程中，甲基化修饰有着十分重要的地位。

甲基化参与基因表达调控在持续影响IBS内脏高敏性的潜在机制研究中有重要作用，应激诱导的IBS内脏痛与脑内DNA甲基化改变有关，导致前伤害性神经递质表达增加［24］。儿童早期创伤作为压力应激也是影响IBS内脏高敏性因素之一，其通过促使糖皮质激素受体基因的高度甲基化，降低糖皮质激素受体的表达，从而降低HPA轴应对压力的有效调控。在IBS的动物模型中发现糖皮质激素受体启动子发生甲基化，糖皮质激素受体基因表达降低，皮质酮水平持续升高［25］。研究发现，在IBS大鼠结肠组织中，甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG binding protein）MeCP2随着血浆同型半胱氨酸和肠上皮细胞紧密连接（tight junctions，TJ）蛋白claudin-1基因甲基化程度的升高而升高，说明MeCP2可能和claudin-1基因甲基化共同抑制了基因的转录和表达［26］。因此，甲基化修饰在IBS内脏高敏发生中有着重要的作用。

3 磷酸化修饰与IBS

磷酸化修饰具有可逆地修饰真核细胞蛋白质的特性。目前发现在人类细胞中已有超过500种蛋白激酶产生巨大的磷酸化蛋白质组，其中包括约20万个单独的磷酸化位点，并且这个数字还在不断增加［27］。磷酸化修饰通过蛋白质激酶和磷酸酶分别参与蛋白磷酸化与去磷酸化，参与调控信号转导、翻译调控以及新陈代谢等重要生命活动［28］。蛋白质激酶可催化腺苷三磷酸（ATP）中的磷酸基团转移到氨基酸侧链上的蛋白底物上，而磷酸酶则可催化磷酸基团的移除，磷酸基团带有负电荷，因此磷酸化与常染色质松弛相关，可促进基因的转录［29］。磷酸化修饰与炎症、免疫、肿瘤等密切相关，Western blot是检测蛋白表达较为灵敏和特异的方法，随着同位素标记、免疫印迹-化学发光等作为核心的磷酸化蛋白质分析方案的不断完善和更新，对磷酸化修饰在疾病中的机制研究也更为清晰与深入［30-31］。

在IBS模型小鼠脑肠轴，即在下丘脑、垂体、结肠中辣椒素受体（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）的表达增多，TRPV1上调及磷酸化被认为是介导痛觉敏化并引发IBS内脏高敏感性的关键性事件之一，蛋白酶激活受体2-蛋白激酶C（PAR2-PKC）通路可通过调控TRPV1磷酸化，激活TRPV1，使TRPV1开放阈值下降，Ca2+内流增加，导致神经末梢去极化，释放神经肽类和兴奋性氨基酸，从而引发内脏疼痛感知异常，最终导致IBS内脏高敏感性的发生［32］。同时TRPV1可被磷酸钙酶（包括钙调神经磷酸酶）负调节。Matsui等［33］发现钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司可使TRPV1介导的脊髓细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化水平升高，从而加重小鼠TRPV1依赖性结肠超敏反应。此外，肠屏障功能障碍是IBS的关键病因，Rodiño-Janeiro等［34］研究发现腹泻型肠易激综合征患者空肠中睾丸特异激酶1（TESK1）介导的编码肌动蛋白1（CFL 1）磷酸化降低，这可能是女性IBS患者肠上皮功能障碍易感性增加的原因。Li等［35］发现二甲双胍干预可抑制IBS大鼠结肠组织肥大细胞活化，从而降低PAR-2表达，抑制丝氨酸位点的ERK活化和肠上皮细胞TJ蛋白claudin-4磷酸化，减轻结肠扩张所致的内脏超敏反应，说明磷酸化修饰可能参与二甲双胍改善IBS肠黏膜屏障功能的机制。此外，一项含麸质饮食（gluten-containing diet，GCD）改善IBS-D（腹泻型）患者症状与肠道通透性的研究显示，使用GCD干预后，患者小肠上皮肌球蛋白Ⅱ调节轻链（MLC）磷酸化增加，并与结肠通透性增高相关［36］。Zhang等［37］发现与健康对照者相比，IBS患者结肠黏膜层中热休克蛋白27（HSP27）高表达，而脂多糖（LPS）刺激可促使HSP27在结肠上皮细胞中的表达，并且使HSP27在丝氨酸78和82位点发生磷酸化，随后采用沉默小干扰RNA验证了HSP27的磷酸化可能通过调节NF-κB通路来保护肠上皮细胞免受损害。因此，磷酸化修饰在IBS内脏高敏性和肠屏障功能障碍的机制研究中有着重要作用。

4 糖基化修饰与IBS

糖基化修饰是常见的PTMs方式之一，也是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程［38］。蛋白糖基化是在肽链合成的同时或合成后，通过糖基转移酶催化，使糖与多种蛋白质氨基酸残基结合形成糖苷键，而后形成糖蛋白，参与机体内细胞黏附、分子识别以及信号转导等过程，其起始于内质网，结束于高尔基体，对蛋白质行使生物学功能起着重要作用［39-40］。糖基化修饰根据糖蛋白糖侧链与蛋白氨基酸基团的不同连接方式，主要分为N-连接糖基化（N-linked glycosylation）和O-连接糖基化（O-linked glycosylation）两大类，而O-连接糖基化又包括OGalNAc、O-GlcNAc、O-Man、O-Fuc、O-Xyl、O-Gal、O-Glc等，以O-GalNAc、O-GlcNAc的研究较为深入。蛋白糖基化在IBS疾病中的研究较少，而在肠道细胞研究中较为广泛，有研究表明糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）及其受体（eceptor for advanced glycation end products，RAGE）在肠道L细胞中有重要作用，AGE与RAGE结合后激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶），通过p38MAPK/NF-κB途径促进肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6的分泌，使肠道L细胞出现炎性损伤反应［41］。此外，肠上皮细胞表面表达和分泌的糖基有独特的功能。肠上皮聚糖在宿主-微生物交互作用中有不可或缺的作用，肠道糖基化在调控微生物的同时也受微生物刺激和肠道免疫系统调节［42］。关于肠道微生物的蛋白质糖基化研究也较多，其大多发生于鞭毛蛋白和黏附素等表层结构中，能调控细菌蛋白的稳定性与活性、宿主的免疫反应，在肠道微生物的生命活动中发挥着重要作用［43］。

研究表明调节肠内多糖水平可以改善IBS肠道动力障碍，IBS患者摄入半乳糖基转移低聚糖（一类多糖）治疗4周后，其粪便黏稠度、胃肠胀气、复合症状评分和主观整体评估等方面有显著改善［44］。而在IBS内脏高敏性方面，研究者发现给予小鼠口服含低聚糖、二糖、单糖和多元醇（FODMAP）的饮食可诱导小鼠产生IBS内脏高敏反应，这与结肠肥大细胞数量增加和结肠上皮细胞晚期RAGE表达增加有关［45］。而口服抗糖化剂吡哆胺后能减轻小鼠内脏高敏性症状，表明抑制糖基化反应可以减轻FODMAPs引起的IBS内脏高敏反应［45］。在肠道黏膜屏障方面，肠道黏液层主要由分泌细胞（如杯状细胞）分泌形成，黏蛋白是肠道黏液层的重要组成部分。Da Silva等［46］发现，与空白对照组相比，IBS模型大鼠肠道黏蛋白Muc2表达无明显差异，而黏蛋白的O-连接糖基化改变明显，出现含有O-聚糖结构的细长的聚氨基葡糖链，影响黏蛋白纤维之间的物理化学作用，与黏液层缺损和功能缺失密切相关。

5 小结和展望

IBS是复杂的胃肠功能紊乱性疾病，其多种临床症状对患者的日常学习、生活、工作和心理等方面造成困扰，给患者生活质量带来严重影响。PTMs与IBS内脏高敏性、肠黏膜屏障等方面关系密切，这为深入研究PTMs在IBS中的作用奠定了基础，为明确IBS的发病机制、临床诊断、治疗提供了更多的潜在靶点。此外，更多种类的蛋白修饰类型被发现以及蛋白质组学技术的发展将有助于深入研究PTMs与IBS的关系，进而更好地揭示IBS的发病机制，为临床治疗IBS提供新的思路。