microRNAs在调控结直肠癌肿瘤干细胞相关信号通路中的作用机制

袁涛，文坤明

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是发病率及致死率均较高的恶性肿瘤，2018年全球癌症统计数据显示，全球结直肠癌发病率在男性、女性恶性肿瘤中分别位列第3位和第2位，死亡率在男性、女性恶性肿瘤中分别位列第4位和第3位［1］。尽管手术方式、放化疗技术的改进使结直肠癌患者的生存率有所提高，但目前结直肠癌的总体生存率仍不满意。最新数据显示结直肠癌的5年总生存率仅为65%，而Ⅳ期患者5年生存率仅12%［2-3］。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤组织中存在的一小部分特殊的细胞亚群，既具有自我更新、多向分化和无限增殖的能力，又表现出肿瘤细胞的特点，它是恶性肿瘤复发、转移及耐药的根本原因［4］。近来研究表明微小核糖核酸（microRNAs）在维持结直肠癌CSCs的自我更新、耐药等干细胞特性方面发挥着重要作用［5］。microRNAs作为今后靶向药物作用位点以及新型肿瘤标志物的潜质得到了大量研究者的关注。本文就microRNAs在调控结直肠癌CSCs信号通路中的作用机制综述如下。

1 microRNAs的合成途径及生物学作用机制

microRNAs是一类长度约为18～25个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，它由DNA转录产生，不直接参与编码蛋白质，但却可以通过RNA诱导的沉默复合体（RISC），在转录后对靶基因的表达实施调控［6］。microRNA的生物合成主要包括以下步骤［7-9］：首先在细胞核内microRNA基因经过RNA聚合酶Ⅱ转录形成初级转录产物pri-microRNA即原始microRNA，之后由Drosha（一种核糖核酸酶Ⅲ）与DGCR8（一种双链RNA结合蛋白）一起构成蛋白复合体对pri-microRNA进行加工、剪切，形成含60～100个核苷酸且具有发夹结构的pre-microRNA即前体microRNA，接着在Ras相关核蛋白GTP酶（Ran-GTP）和转运蛋白Exporting-5共同作用下，由细胞核转运到细胞质中，最后在细胞质中Dice酶（一种核糖核酸酶Ⅲ）识别pre-microRNA的双链部分并将其茎环基部的两圈螺旋解开，Dicer酶对两条链进行切割形成含有22个核苷酸的microRNA双链体，其中一条与RISC结合形成成熟的microRNA，另一条互补链则被降解。microRNAs 5′端第2～7个核苷酸与目的基因3′端非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR）结合的部位称为种子序列。microRNAs可以通过降解或抑制目的基因翻译两种途径参与转录后调控，但对目的基因具体所起的作用，还要取决于microRNAs 5′端与靶基因mRNA 3′-UTP碱基互补配对程度。当microRNAs 5′端与靶基因mRNA 3′-UTP完全配对时，靶基因mRNA被Argonaute（AGO）蛋白的核酸内切酶降解。但大多数情况下microRNAs 5′端与目的基因mRNA 3′-UTP不完全配对，而是主要通过抑制目的基因mRNA翻译调控基因转录过程［10］。

2 microRNAs在调控结直肠癌CSCs相关信号通路中的作用

越来越多的证据表明，microRNAs可以通过CSCs相关信号通路对结直肠癌CSCs起调控作用［11］。这些通路主要包括Wnt/β-catenin［12］、Notch［13］、JAK/STAT3［14］、Hedgehog（HH）［15］、上皮间质转化（EMT）［16］等。

2.1 Wnt/β-catenin信号通路研究表明Wnt信号通路对肠道干细胞的存活和肠道内环境的稳定至关重要，而其中Wnt/β-catenin信号通路在约90%的结直肠癌中发生突变，这些突变主要存在于大肠腺瘤性息肉病（APC）和β-catenin基因中［17-18］。Wnt/βcatenin信号通路不仅在细胞增殖、分化，调节组织的动态平衡和自我更新方面起关键作用，对于维持CSC的自我更新和治疗抵抗也起重要作用［17］。Yu等［19］通过研究发现，相较于结肠癌亲本细胞（HCT-116和HT-29），miR-21在 结 肠 癌CSCs（HCT-116CSCs和HT-29CSCs）中表达明显上调；同时在结肠癌细胞（HCT-116）中过表达miR-21增加了结肠CSCs的比例，结肠CSCs的自我更新能力提高了60%～80%。进一步研究表明过表达miR-21可通过靶向调控转化生长因子β受体Ⅱ（TGFBR2）抑制表达，而TGFBR2的下调导致Wnt/β-catenin信号通路、T细胞特异性转录因子/淋巴增强因子结合因子的激活，并增加下游靶基因c-Myc和cyclin-D1的表达，从而在结肠CSCs调节中发挥重要作用。Jiang等［20］研究发现miR-30-5p在结直肠癌组织和CD133+CRC细胞中表达下调，而过表达miR-30-5p则明显降低了CD133+CRC细胞干细胞标志物（CD133和Sox2）的表达和成球能力，进一步研究表明miR-30-5p通过靶向调控Wnt/β-catenin靶基因（Axin2和myc）的表达而抑制结直肠癌CSCs的特性和耐药性。但Axin2和myc与miR-30-5p作用机制仍有待进一步研究。上述研究表明microRNAs可以通过靶向调控Wnt/β-catenin信号通路从而参与结直肠癌CSCs的调控，这部分microRNAs有望成为结直肠癌治疗的潜在靶点。

2.2 Notch信号通路Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，调节多种生物细胞的生长发育、凋亡、增殖及细胞边界的形成，同时能够促进不同类型的癌症进展［21］。在正常干细胞中，Notch通路是不对称分裂的关键调节因子，与正常干细胞的情况类似，干扰不对称分裂可以改变CSCs自我更新和分化之间的平衡，并影响肿瘤生长［22］。大量研究表明Notch信号在多种CSCs中过度激活，已证实Notch的激活突变与结直肠癌［13］、乳腺癌［23］、肺癌［24］CSCs表型的获得及自我更新有关。Jin等［25］发现miR-195-5p在32例结直肠癌组织中表达明显下调，通过结直肠癌细胞系（SW620和HT29）在干细胞培养基中培养出SW620 CSCs和HT29 CSCs，发现过表达miR-195-5p后CSCs标志物（CD133和Sox2）表达下调、成球能力减弱、裸鼠体内成瘤能力下降，进一步研究发现miR-195-5p直接靶向调控Notch信号蛋白（Notch2和RBPJ）的3′UTR，抑制CSCs的干性和肿瘤生长。Bu等［26］通过从新鲜结肠癌组织中培养出CSCs，实时荧光定量PCR（qPCR）证实结肠癌CSCs中miR-34a表达下调，进一步研究发现miR-34a充当Notch信号通路的切换开关，即miR-34a通过靶向Notch信号通路调节结肠癌CSC自我更新和肿瘤形成。Bu等［27］发现miR-34a可通过与Notch1和Numb（一种抑癌基因）mRNA的3′UTR结合来抑制Notch1和Numb翻译，Numb则通过促进Notch1的内吞和降解来抑制Notch1，即miR-34a、Numb和Notch1形成不连贯的前反馈回路，调节小肠和结肠癌中的不对称干细胞分裂。以上研究表明microRNAs可以通过靶向Notch通路干扰结直肠癌CSCs的不对称分裂，进而调控结直肠癌CSCs的自我更新。

2.3 JAK/STAT3信号通路Janus激酶信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路最初是在干扰素（IFN）-α、IFN-γ和白细胞介素-6（IL-6）介导的下游信号通路中发现的［28］。已证实JAK/STAT3在包括CRC在内的多种肿瘤中过度激活［29］。在STAT蛋白家族的7个成员中，STAT3对促进肿瘤的发生发展尤为重要，是肿瘤治疗最有前途的新靶点之一。目前研究认为STAT3信号通路在调控CSCs的自我更新中起重要作用［30］。有研究表明microRNAs可以通过直接靶向或通过STAT3上游或下游的靶基因激活STAT3信号通路［31］。Ren等［14］发现miR-196b-5p在大肠癌组织中表达显著上调并且与大肠癌患者的预后不良有关，结直肠癌细胞系（SW480和HT116）过表达miR-196b-5p后，上述结直肠癌细胞的成球能力增强、侧群细胞（SP细胞）比例增加、干细胞因子（NANOG、BMI-1、OCT4和Sox2）的表达上调；沉默miR-196b-5p后上述指标变化趋势则相反；进一步研究表明miR-196b-5p通过靶向调控STAT3信号通路的负调控因子SOCS1和SOCS3，激活STAT3信号通路，从而促进CRC细胞的干性和对5-氟尿嘧啶的耐药性。

2.4 HH信号通路自从在果蝇中首次发现HH信号通路以来，HH信号通路受到了广泛的关注［32］。目前研究已证实HH信号通路与细胞生长分化密切相关，不仅在内环境稳态、干细胞调控、组织再生方面发挥重要作用，而且在多种肿瘤组织与细胞系中异常激活并参与肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、血管生成、侵袭转移和CSC的维持［33］。microRNAs通过HH通路调控结直肠癌CSCs，可能与microRNAs参与调控与细胞分化相关的信号通路有关。Wang等［34］利用肿瘤基因图谱数据分析发现miR-372/373在607例CRC患者癌组织中表达上调，进一步研究发现过表达miR-372/373可通过增加结直肠癌CSC标志物阳性细胞（CD24+CRC、CD26+CRC、CD44+CRC和CD133+CRC）的比率而增强结直肠癌CSCs的特性，表现为自我更新、化疗耐药性以及侵袭能力的增强。为了研究miR-372/373诱导干性的机制，Wang等［34］通过细胞信号通路分析发现，当过表达miR-372/373后，与CRC干性相关的HH通路表达上调；而与分化相关的信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK/Erk）通路和维生素D相关受体（VDR）通路等则被miR372/373明显抑制，提示miR-372/373通过抑制分化基因的表达来增强CRC的干性，该研究为结直肠癌靶向治疗提供了新的思路，然而关于HH通路和分化相关的信号通路仍然知之甚少，需要更深入的研究。

2.5 EMT EMT过程不仅参与肿瘤转移，而且与CSCs特性的获得与保持也密切相关，经历EMT的肿瘤细胞可以获得CSCs特性。大量研究发现在多种上皮肿瘤细胞内过表达EMT启动子（Twist1或Snail）激活EMT后，肿瘤细胞出现了多种CSC特性，包括CSC特异性细胞表面标志物表达的升高、悬浮培养肿瘤细胞成球能力的增加、小鼠体内致瘤能力的增加［35-36］。有研究认为，EMT激活后癌细胞分泌蛋白谱发生改变，导致其建立了自分泌信号通路，这有助于肿瘤细胞干性的出现［37］。Zhu等［16］通过建立稳定过表达Snail（EMT转录因子）的结直肠癌细胞系（DLD1-Snail和HCT116-Snail），发现其干细胞特性增强，同时产生了放疗抵抗，通过miR-145启动子荧光素酶实验还发现Snail可以结合miR-145启动子的核心序列并抑制miR-145表达，反之，过表达miR-145则逆转了Snail介导的干细胞特性并恢复癌细胞对放疗的敏感性。Ning等［38］研究证实miR-147在结肠癌细胞中表达下调，进一步在CRC细胞系（HCT116和SW480）中过表达miR-147后发现EMT过程被抑制，表现为上皮标志物E钙蛋白表达升高，间质标志物纤维连接蛋白和波形蛋白表达降低，同时CSC标志物（OCT4、Sox2和NANOG）的表达下调，经EMT诱导剂转化生长因子β1（TGF-β1）激活EMT后，上述指标变化趋势相反，表明过表达miR-147通过抑制EMT过程进而抑制CRC的CSCs特性。以上研究结果表明microRNAs可以通过靶向调控EMT过程在调控结直肠CSCs中发挥作用。尽管CSCs与EMT的相关性在大量研究中得到证实，但具体的分子机制仍不清楚，仍需要更深层次的研究。

3 小结与展望

尽管大量研究表明microRNAs通过靶向不同的信号通路及EMT调控结肠CSCs的干性。但关于microRNAs的具体功能和调控结直肠癌CSCs详细机制仍不清楚。目前以microRNAs为靶点治疗结直肠癌研究的实验对象多基于离体细胞，尚缺乏足够的临床研究数据。因此，仍需大量的动物实验和临床研究验证体外试验的结果。已知的与结直肠癌CSCs相关的microRNAs较多，如何筛选及验证与结直肠癌CSCs确切相关的microRNAs，以及是否能结合其他预测指标，建立预测模型和microRNAs在结直肠癌CSCs的表达谱，用于指导临床上个体化治疗，都是亟待解决的问题，故需要更加优良的实验设计来进一步研究。开发专门针对结直肠癌CSCs的治疗方法仍任重而道远。