超声靶向微泡破坏技术在心肌梗死基因治疗中的应用

邹云雷，刘小慧，胡兵，刘朝奇，赵云

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉供血急剧减少或中断，使相应的心肌因严重而持久的急性缺血而坏死［1］。AMI后，尽早再灌注治疗可减少急性心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤、挽救存活心肌和限制心肌梗死范围。近年来，随着治疗方法的改进及治疗水平的提高，AMI患者的短期存活率得以提高，但继发的并发症（如心律失常、心力衰竭和心源性休克等）仍是患者死亡的重要原因，AMI后心源性休克患者的病死率高达40%以上［2］。因此，如何有效控制AMI并发症、提高AMI的治愈率备受关注。近年来，随着人们对心肌梗死分子机制了解的深入，就基因治疗心肌梗死进行了大量的实验研究，心肌梗死的基因治疗手段逐渐丰富。然而，由于缺乏安全有效的靶向递送系统，转染基因难以持续表达，基因治疗的临床应用受到限制。超声靶向微泡破坏（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）技术作为一种新兴的药物递送方式，具有侵袭性小、特异性强、转染效率高等优势，已经被成功地应用于临床试验中［3］。本文对UTMD在心肌梗死基因治疗中的应用研究进展综述如下。

1 UTMD介导基因递送

1.1 UTMD技术应用的微泡载体特点UTMD技术使用的微泡，包括全氟丙烷脂质微泡、人血白蛋白八氟化丙烷微泡和六氟化硫微泡，与超声成像中常用的对比剂在结构和声学特性方面有诸多相似之处［4］。其气泡壳可以由脂类、白蛋白、糖类或生物相容性聚合物组成。壳材料可添加带电的脂质来改变壳层电荷，从而产生阳离子微泡，使核酸能够与微泡电荷耦合。微泡内由气体填充，第一代微泡常填充空气或氮气，第二代微泡主要填充全氟化碳或六氟化硫等高分子惰性气体。由于第二代微泡惰性气体在血液中的溶解度较低，微泡的稳定性更好，从而延长了微泡在血液循环中的持续时间。微泡直径通常在0.5～10μm，小于或接近正常红细胞的直径（6～9 μm），因此其注入静脉后能够顺利地通过肺循环。超声微泡成像已经广泛应用于心脏、甲状腺、肝脏等脏器的临床诊疗中，其安全性好，无肝肾毒性，仅有轻微和短暂的不良反应。微泡载体递送基因使用了3种策略：（1）微泡与基因共给药（分离/不偶联）；（2）电荷作用将基因耦合到微泡表面；（3）基因或偶联蛋白与微泡壳或管腔结合。第1种策略的基因需与其他保护性载体，如质粒、带正电的脂质体、多聚复合物等相结合。此种方式较简单且易于转化应用于临床，但超声束照射范围以外的组织也可同时发生非特异性转染。此外，由于声穿孔效应的短暂性，要输送的药物必须位于超声微泡附近，因此转染的效率和靶向性较后两种策略差。而第2、3种策略是将微泡直接作为载体，其显著优势是，当载基因的微泡输送至靶细胞表面时，短暂的声穿孔效应为基因的细胞内转染提供了有限的时间，提高了转染效率。第2种策略是基因通过静电吸附耦合至阳离子脂质微泡表面，此种微泡容易制备，但微泡的负载能力受限于其表面积，因此必须注入大量的微泡才能达到预期的效果。第3种策略是将质粒DNA掺入可生物降解的聚合物微泡的气体核中，这种方法不仅可以保护质粒免受宿主核酸酶的降解，而且可以使每个微泡获得较高的质粒负载。这种聚合物微泡的优点是可以同时引入疏水性和亲水性药物，但其制备工艺较为复杂，影响包封率的工艺因素较多，例如分散技术、聚合物的组成、温度、离子强度等［5］。

1.2 UTMD技术介导基因转染的机制UTMD技术介导基因转染主要是通过静脉注射或静脉滴注的方式，将微泡核酸复合物递送至心脏或靶血管床，然后利用间歇性高功率超声辐照破坏微泡，在特定部位释放高浓度基因。UTMD技术通过声孔、局部剪切力、局部冲击波、空化微射流和内吞作用等机制，提高了基因在局部的转染效率。有研究表明，在超声束照射范围以外很少发生基因转染，显示了UTMD的靶向性和安全性［6］。UTMD技术介导基因递送的主要机制有：（1）微泡可增强超声空化效应。（2）微泡在特定部位被击破后释放基因，可提高靶器官或病灶局部的基因浓度。（3）将核酸与微泡结合，可防止核酸被内源性脱氧核糖核酸酶降解，延长其循环半衰期。

1.3 UTMD技术转染优化超声参数包括超声功率、脉冲或触发间隔、超声频率、辐照时间等。机械指数（mechanical index，MI）是声功率的一种替代测量方法，MI越高通常提示UTMD技术转染效率越高，但过高的MI也会导致靶组织内微血管漏、溶血性毛细血管破裂、出血等不良反应的发生。与连续超声相比，触发超声的转染效率更高，主要是因为触发超声允许微泡基因复合物在脉冲之间有更多的时间进入微血管。有关脉冲间隔时间对转染影响的研究尚少见。Fujii等［6］在大鼠异位乳腺癌模型中，利用UTMD技术介导血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）短发夹RNA（shRNA）质粒转染，评估脉冲间隔时间分别为2、5、10、20 s时VEGFR2基因敲除和肿瘤血管生成抑制作用的差异，结果显示，脉冲间隔时间为10 s时，VEGFR2基因敲除效率和肿瘤血管生成抑制作用最优；当脉冲间隔时间为10 s时，肿瘤组织刚好完全被微泡填充。一般认为超声波频率越低，UTMD技术的转染效率越高。在对比剂充足的情况下，延长辐照时间可以破坏更多对比剂，在相同的辐照时间下，间隔多次辐照的递送效果优于单次辐照。

为了优化UTMD技术的转染效果，还需要考虑非超声参数，如DNA用量、微泡因素、靶组织类型、注射方式等。一般认为，微泡的粒径越小，微泡膨胀率就越大，UTMD技术介导的基因递送效果也就越好。与静脉注射相比，动脉注射时血管周围的转染率更高。

2 心肌梗死的基因治疗

2.1 治疗心肌梗死的潜在靶基因

2.1.1 血管新生基因重新血管化被认为是减轻心室不良重塑和改善心脏功能的有效方法。多种途径和分子参与了血管生成的启动和调节，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板生长因子（PDGF）等可进入梗死区促进血管生成［7］。VEGF是一种对内皮细胞特异的有丝分裂原，参与血管生成的诱导，通过酪氨酸激酶受体途径促进内皮细胞分化和迁移。Thirunavukkarasu等［8］研究显示，被诱导心肌梗死后的糖尿病小鼠给予VEGF和血管生成素（Ang）-1联合干预后，其新生血管明显增多。HGF在早期心脏发育中起关键作用，可诱导有丝分裂、抑制细胞凋亡、促进血管生成及减少心肌纤维化。HGF基因修饰的间充质干细胞（MSCs）可促进心肌血管的新生和恢复。此外，HGF可减轻心肌梗死模型的炎症反应，其可能通过调节炎症细胞因子发挥心肌梗死的治疗作用，但HGF对促炎细胞因子的调节机制尚不明确。有研究表明，人肝细胞生长因子重组腺病毒（Ad-HGF）可降低心肌梗死大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的基因和蛋白表达水平，提示HGF改善左室重构可能是通过下调促炎细胞因子来实现的［9］。

2.1.2 抗梗死区纤维化基因心肌梗死后会发生心肌纤维化，其特征是梗死区细胞外基质（ECM）过度沉积，导致组织硬化，限制心脏的收缩和舒张功能。虽然最初形成的纤维化组织具有防止心脏破裂的作用，但持续的心肌纤维化将导致心功能下降。转化生长因子（TGF）-β与心肌成纤维细胞中的TGF-β受体（TGF-βRS）结合形成的肌成纤维细胞是导致心肌纤维化的原因。因此，为了防止心肌纤维化的进展，抑制肌成纤维细胞的形成至关重要。目前主要采用TGF-β抑制剂或抗TGF-β抗体全身给药的方法，以减少心脏中活性TGF-β的数量，进而抑制肌成纤维细胞的形成。bFGF是通过增加梗死区心脏血管的生成间接发挥抗纤维化作用。近期有研究证实，bFGF亦能够抑制由TGF-β诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，直接发挥抗纤维化作用［7］。

2.1.3 增加心肌收缩力的基因基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是一种锌依赖性蛋白酶，在心肌I/R损伤时被激活，导致心肌收缩功能障碍。MMP-2定位于心肌细胞内的几个亚细胞部位，但其在肌浆网（SR）中的作用尚不清楚。Ca2+ATP酶SERCA2a可将胞浆Ca2+泵入SR，促进肌肉松弛，但该酶在I/R中被降解。MMP抑制剂ARP-100在I/R时可阻止70 ku-SERCA片段形成，该片段在再灌注结束时与心肌收缩功能呈负相关［10］。

2.1.4 再生心肌梗死后心脏的再生一直是研究者努力的方向。越来越多的临床前研究表明，各种类型的干细胞移植，如骨髓源性单核细胞（BMMNCs）、MSCs、循环祖细胞（CPCs）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）等及其衍生物，可改善AMI后心功能［11］。然而，由于移植细胞在缺血心脏的植入和存活不佳，干细胞移植在改善心肌收缩功能和瘢痕减少方面的研究进展十分有限。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可以动员骨髓中的多潜能祖细胞进入外周血，减少心肌梗死面积，改善梗死后的左心室重塑。目前，G-CSF保护心脏的机制是将骨髓祖细胞亚群转分化为心肌细胞、血管内皮细胞、血管α-平滑肌肌动蛋白和肌成纤维细胞，加速愈合过程以及预防心肌细胞凋亡。在大量G-CSF治疗AMI的动物实验基础上，研究者进行了多项临床试验，结果存在很大差异，这可能与G-CSF的剂量、给药时间、持续时间和研究对象选择差异有关［12］。

2.2 RNA干扰（RNAi）策略在心肌梗死治疗中的应用近年来，基因沉默成为心血管疾病基因治疗的热点。小干扰RNA（siRNA）是长21～23 nt的双螺旋RNA序列，能高效、特异地靶向mRNA的序列，用于下调疾病相关基因、蛋白或受体的表达。通过RNAi下调TGF-β、Src同源区2、晚期糖基化终产物受体（RAGE）和CD47等多种炎性因子可治疗I/R损伤［13］。Zhang等［14］研究发现，利用X非活性特异性转录本（XIST）siRNA对长链非编码RNA（lncRNA）XIST基因进行敲除，可通过下调miR-449的表达，抑制AMI模型大鼠心肌细胞凋亡，减轻心肌病理损伤，从而增强心功能。

同样，微小RNA（miRNA）从Watson-Crick模型到基因沉默载体的研究取得了进展。与siRNAs相似，miRNAs在改变基因功能方面也发挥着重要作用。miRNA由长约22 nt的双链RNA片段组成，其通过与mRNA上的碱基互补序列结合，抑制mRNA翻译或促进mRNA降解，调节基因表达。大量研究表明，miRNAs参与了AMI的发病过程，miRNAs的变化包括miR-15b、miR-21、miR-199、miR-214表达上调和miR-29c、miR-150表达下调。AMI后，由于心肌成纤维细胞中miR-29表达下调，一些纤维化基因的表达增加，而miR-29的过度表达能够降低这些纤维化基因的表达，提示miRNA可以作为抑制AMI后心肌纤维化的治疗靶点［15］。

3 UTMD技术在心肌梗死基因治疗中的应用

3.1 提高UTMD技术介导基因转染效率的方法静脉注射脂质微泡已被证明在临床评价心肌灌注和临床前心脏基因递送方面是成熟的。Cao等［16］将冠状动脉基因灌注联合UTMD技术应用于心肌梗死的治疗，结果表明，冠状动脉注射较静脉注射可提高Ang-1质粒的转染效率，上调外源性血管生成基因的表达，促进血管生成，改善心室重塑。此外，核定位信号（NLS）是一种来源于真核蛋白和病毒蛋白的功能性多肽，可以有效地介导分子的核内转运。Cui等［17］以UTMD技术和NLS的生物学功能为基础构建了一个基因传递系统，结果表明，Ang-1基因在犬缺血心肌中的转染效率约为单纯UTMD技术系统的1.6倍，提示NLS通过抑制细胞质中转移基因的降解，有助于外源DNA片段的稳定。

3.2 UTMD技术介导基因沉默基因抑制疗法以干预基因转录和翻译为目的，越来越受到研究者的重视。在大鼠实验中，shRNA通过UTMD技术介导针对脯氨酰羟化酶2（PHD2）、G-CSF、S100A6、MMP-2、穿膜肽（TATp）、外周血干细胞因子（SCF）和基质细胞衍生因子（SDF）-1α的局部传递，可有效减少心肌梗死面积、改善心肌重塑和血管重构［18-20］。研究发现，UTMD技术介导的shPHD2转染成功地实现了PHD2基因的敲除，通过上调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、VEGF和bFGF的表达，对心肌细胞H9C2产生HIF-1α依赖性的保护作用；该研究将UTMD技术介导的shPHD2基因转染至大鼠缺血模型的局部缺血心肌中，可沉默PHD2，通过上调其下游基因，从而发挥减少心肌梗死面积和改善心功能的作用［18］。

3.3 UTMD技术用于增加基因表达的治疗超声微泡可作为小鼠体内VEGF、SCF、生长分化因子（GDF）11，兔体内CD151和Ang-1，猪体内miR-21和犬体内HGF的有效载体［21-24］。Su等［25］将携带SDF-1α基因的腺病毒加载到微泡载体上，利用UTMD技术将腺病毒释放到AMI大鼠体内，通过检测骨髓间充质干细胞（BMSCs）从外周血归巢至梗死心肌的数量，探讨SDF-1α在梗死心肌中过度表达诱导BMSCs自体移植的可能性，结果显示转染后外周血SDF-1α水平明显升高，外周血和梗死区BMSCs数量明显增多，提示随着SDF-1α表达水平的升高，归巢BMSCs数量增加。因此，外源性SDF-1α基因通过UTMD技术介导对AMI大鼠心肌细胞的递送，能有效促进内源性BMSCs向心脏归巢，归巢干细胞的数量受SDF-1α表达水平的控制。Shentu等［26］将抗P-选择素单克隆抗体与脂质壳结合，制备了靶向P-选择素的pcDNA3.1-人血管内皮生长因子165（pCDNA3.1-hVEGF165）磷脂微泡，通过UTMD技术技术的支持，利用靶向超声对比剂对缺血心肌进行鉴定，释放pCDNA3.1-hVEGF165重组质粒，证实UTMD技术介导VEGF的释放可增加心肌血管密度，改善心功能。

3.4 UTMD技术在心肌I/R损伤中的应用I/R是心力衰竭的主要危险因素之一，而内源性干细胞的再生能力在损伤后的组织修复中起着重要作用。在衰老的个体中，干细胞的再生能力降低，组织缺乏更新能力。经UTMD技术多次应用肿瘤坏死因子受体相关因子3交联蛋白（2TRAF3IP2）、GDF11、VEGF-a、胰岛素样生长因子（IGF）-1、Cav-3、骨髓细胞、MMP-2、Akt1均能恢复老年心脏功能，保护其免受I/R损伤［20，27-29］。有研究表明，采用UTMD技术介导的GDF11质粒在I/R后向老年老鼠心脏的传递，有效且选择性地增加了GDF11在心脏中的表达，改善了心功能，缩小了梗死面积，在老年老鼠心脏细胞中，GDF11的过度表达降低了衰老标志物p16和p53的表达；此外，GDF11过度表达后，心脏干细胞抗原1（Sca-1+）增殖增加，老年缺血性心脏出现内皮祖细胞归巢增加和血管生成，经UTMD技术重复靶向传递GDF11基因，可使衰老小鼠心脏恢复活力，保护其免受I/R损伤［21］。Chen等［30］研究发现，经UTMD技术延迟向缺血心肌输送骨髓细胞（BMC），可显著减轻I/R后的心脏重塑，类似于甚至优于早期BMC治疗，UTMD技术联合延迟BMC治疗后，组织病理学显示毛细血管密度增大，心肌细胞、c-kit+细胞增殖增加；此外，超声靶向的微泡空化和外源性BMCs的旁分泌作用，可促进血管生成并诱导VEGF分泌。因此，新血管形成、心肌细胞和c-kit+细胞增殖可能是UTMD技术联合延迟BMC治疗减轻心肌梗死后心脏重塑的机制。

4 小结

利用UTMD技术介导基因控释有望成为心肌梗死基因治疗的一种非侵入性技术，在心肌梗死基因治疗领域具有潜在的优势和应用前景。但其在临床应用前尚存诸多问题亟待解决：（1）需要优化微泡制备方法，保持微泡声学特性，延长其循环时间。（2）提高微泡携带基因的有效载荷，防止基因被单核细胞清除，增强其区域内的组织结合力。（3）改进靶向技术，减少靶向超声爆破时引起的微血管漏、心内溶血性毛细血管破裂、出血、炎症细胞浸润、心肌细胞损伤等不良反应的发生。