播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平及靶标抗性分子机理

孙鹏雷，王恒智，刘伟堂，赵 宁，王 豪，朱宝林，王金信

(1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018；2.山东省农药毒理与应用技术重点实验室，山东泰安 271018)

播娘蒿(DescurainiasophiaL.)为十字花科播娘蒿属一年或越年生阔叶杂草，是我国黄淮海区域麦田主要恶性杂草之一[1-2]。双氟磺草胺(florasulam) 是一种三唑并嘧啶磺酰胺类(triazolopyrimidine sulfonanilides,TP)内吸传导型除草剂，由美国陶氏农业科学公司开发，具有低毒高效、在低温下稳定、杀草彻底及对人畜等高等动物安全等特点，是继苯磺隆之后，我国麦田广泛应用于阔叶杂草防治的另一重要乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS,EC2.2.1.6)抑制剂类除草剂品种[3]。近年来，由于该除草剂持续大量使用，其在黄淮海区域麦田对播娘蒿的防治效果逐年下降，部分地区麦田播娘蒿对双氟磺草胺已经表现出明显的抗性。

ALS能够高效地催化植物体内的部分生物反应，参与多种氨基酸的合成过程，对植物的正常生长具有重要作用[4-5]。以ALS 为靶标的除草剂主要有5种类型：咪唑啉酮(imidazolinones,IMI)、磺酰脲类(sulfonylureas,SU)、三唑并嘧啶类(triazolopyrimidines,TP)、嘧啶硫代苯甲酸酯类(pyrimidinylthiobenzoates,PTB)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(sulfonylaminocarbonyl-triazoli-nones,SCT)[6]。由于ALS 抑制剂类除草剂作用位点单一，杂草易对其产生抗药性。据统计，从20世纪50年代至今，在全球已报道的512种抗性杂草生物型中，对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的杂草生物型已有165种[7]。研究发现，植物体内ALS基因突变，是其对ALS抑制剂类除草剂的敏感性降低的重要原因[8]。此外，近年来非靶标(代谢)抗性机理导致的杂草对ALS抑制剂类除草剂的抗药性现象在多种杂草中被频繁报道[9-10]。

自1992年首次报道毒莴苣(LactucaserriolaL.) 和地肤(KochiascopariaL.)因ALS 第197位氨基酸突变引起对磺酰脲类除草剂氯磺隆产生抗性以来，ALS 基因测序分析在杂草对ALS 抑制剂类除草剂的抗性机理研究中被广泛应用。据统计，目前被证实可以导致杂草产生抗性的ALS氨基酸序列位点共报道了8个：第122、197、205、376、377、574、653和第654位点，氨基酸取代形式已有29种[11]。Cui等[12]和Deng等[13-14]分别发现播娘蒿在ALS基因发生突变会导致其对SU、IMI、PTB、TP、SCT类药剂产生不同程度的抗性；Yang等[10]发现，马拉硫磷对抗苯磺隆播娘蒿存在逆转作用，证实马拉硫磷可以抑制磺酰脲类除草剂的代谢，从而逆转基于代谢的抗性。与靶标抗性相比，非靶标抗性更复杂且不可预测。目前，在播娘蒿对ALS抑制剂类除草剂的抗性研究中，对苯磺隆的抗性研究居多[15-17]，但是，目前尚未见有关黄淮海区域麦田播娘蒿对双氟磺草胺抗性的报道。

本研究采用整株-剂量响应法测定山东省泰安市多年用双氟磺草胺和未用除草剂小麦田播娘蒿种群对双氟磺草胺的抗性水平，比较两个播娘蒿种群对双氟磺草胺的敏感性，并分析其ALS基因序列差异，以探究播娘蒿对双氟磺草胺产生抗性的分子机理，为播娘蒿的科学防治及延缓抗药性产生提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

播娘蒿种子：种群G130于2018年采自中国山东省泰安市泰山区小麦田(N36.19°， E117.17°)，该田块自2013年以来长期使用双氟磺草胺；种群TS采自山东泰山(N36.05°, E117.01°)，从未使用过任何除草剂。

除草剂：50 g·L-1双氟磺草胺悬浮剂，山东胜邦绿野化学有限公司生产; 97%双氟磺草胺原药，山东滨农科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平测定

采用整株-剂量响应法[18]测定。选取饱满的播娘蒿种子，以30% H2O2浸泡30 min，用清水冲洗干净后，在50 ℃温水中浸泡40～60 min，将处理好的种子放于9 cm的含滤纸培养皿中，加入 0.05% GA3置于光照培养箱(光/暗时间 14 h/10 h；温度25 ℃/20 ℃)中浸泡12～24 h，用清水冲洗干净；保持湿润继续培养至种子露白；挑选长势良好的15粒种子种植在直径15 cm的一次性塑料盆钵中，均匀覆土，放置在温度为 20～25 ℃、相对湿度为50%～75%的自然光照可控温室中进行常规培养。2～3叶期时，间苗至10株。于4～5叶期进行茎叶双氟磺草胺喷雾处理(ASS-4 型定量喷雾塔，喷液量450 L·hm-2，喷雾压力275 kPa)。不同种群双氟磺草胺处理剂量(有效成分)不同，其中TS种群剂量分别为0、0.006、0.03、 0.15、0.75、3.75、18.75 g·hm-2；G130种群剂量分别为0、 0.15、0.75、 3.75、18.75、93.75、468.75 g·hm-2。每处理设置3个重复，整体试验重复2次。药剂处理后 21 d，剪取播娘蒿地上部分茎叶置于牛皮纸袋中，在75 ℃恒温干燥箱中烘72 h后，称干重。

1.2.2 播娘蒿种群ALS基因检测

根据1.2.1方法分别催芽、种植两个种群播娘蒿，待播娘蒿长至4～6叶期后，剪取单株播娘蒿的幼嫩叶片，进行液氮处理后，-80 ℃保存备用。播娘蒿DNA采用CTAB法[19]提取。PCR扩增参照许 贤等[20]的方法，ALS基因序列扩增引物为5′-CGCTCCTCTCCTGAAGCTCACCA-3′(F)和5′-CAAACAAACAGCAGTAGC GTC TGAAG-3′(R)，目标长度2 100 bp。反应体系共25 μL：18.25 μL dd H2O,2.5 μL10 × Easy Taq Buffer，1 μL d NTPs，正、反向引物各1 μL(10 μmol·L-1)，1 μL模板，0.25 μL Easy Taq DNA Polymerase。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共34个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。扩增序列覆盖全部被报道过的8个ALS区域突变位点。

PCR 扩增结束后，将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit 对阳性目的条带进行回收，使用pEASY-T1 Simple Cloning Kit 对胶回收产物进行连接反应，转化培养。将培养好的菌液进行阳性克隆鉴定并送生工生物工程(上海)有限公司测序，采用DNAMAN v 6 软件对测序结果进行分析。

1.2.3 离体ALS对双氟磺草胺敏感性测定

播娘蒿催芽方法依照1.2.1，露白后种植在50孔育苗盘中。待播娘蒿长至4～6叶期时，分别剪取两个种群播娘蒿叶片，迅速置于液氮中处理，-80 ℃保存备用。播娘蒿ALS提取及活性测定参照Han等[21]和Yu等[22]的方法，并稍加改动。ALS离体活性测定所用双氟磺草胺浓度通过预试验结果制定，设定敏感种群双氟磺草胺浓度分别为0、0.000 256、0.001 28、0.006 4、 0.032、0.16、0.08和4 μM；抗性种群浓度分别为0、0.001、0.01、 0.1、1、10、100和1 000 μM，暗反应时间设为45 min，试验结束后，用Spectra Max M2 新多功能酶标仪在530 nm下测定其吸光度值。试验设置3个重复，整体试验重复2次。

1.3 数据处理

采用SPSS 25.0软件的ANOVA 方法进行差异显著性分析。通过SigmaPlot 12.5软件的双逻辑非线性回归方程y=C+{(D-C)/[1+(x/GR50)b]}计算干重抑制中量GR50。式中，C表示剂量反应下限；D表示剂量反应上限；x表示除草剂用量；b表示曲线斜率；GR50表示植株干重减少50%所需除草剂剂量；y表示在某一除草剂剂量下干重占空白对照比值。计算其抗药性指数(RI)，即抗性种群(G130)的GR50与敏感种群(TS)的GR50的比值，分析其抗药性指数(RI)(高水平抗性RI>10)[23]。以I50替换回归方程中的GR50计算抑制播娘蒿ALS酶活性50%所需除草剂浓度。

2 结果与分析

2.1 播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平

抗性水平测定结果(表1)显示，双氟磺草胺对敏感种群TS 的GR50值为0.10 g·hm-2，对抗性种群G130的GR50达10.86 g·hm-2，与敏感种群TS相比，播娘蒿种群G130对双氟磺草胺已产生高水平抗药性，抗药性指数为108.6。

表1 播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平

2.2 抗性、敏感播娘蒿种群ALS基因差异

将两个播娘蒿种群的ALS测序结果与NCBI上登记的拟南芥ALS基因序列(X51514)在线BLAST，有90%以上的同源性，确定所扩增序列为目的序列。用DNAMAN 6.0.3软件将所测不同种群播娘蒿核苷酸序列翻译后进行氨基酸比对分析，在G130种群中，发现了两种突变:第197位脯氨酸突变为苏氨酸，第574位色氨酸突变为亮氨酸(图1)，有些单株中同时存在着197苏氨酸和574亮氨酸突变。为明确在G130种群中各突变形式的发生频率，本研究随机挑选100株该种群植株进行了基因组DNA提取、PCR扩增、链接转化和菌液测序。结果表明，在G130种群中三种突变形式及突变频率如图2所示，其中33%的植株存在197苏氨酸突变，40%的植株存在574亮氨酸突变，27%植株同时存在两种突变。该两种突变形式已被证实可以导致杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗性[14]。随着双氟磺草胺选择压的持续增加，对杂草产生抗性有贡献的突变比例会不断升高，杂草防治工作将更加困难。

图1 播娘蒿抗性种群G130的ALS基因突变形式

图2 抗性播娘蒿突变位点及突变频率

2.3 ALS离体活性测定

靶标酶ALS离体活性测定结果表明，G130种群的ALS总催化活性为16.52 nmol·mg-1·min-1，敏感种群TS总催化活性为14.60 nmol·mg-1·min-1。当双氟磺草胺浓度达到1 μM时，抗性种群ALS活性未受明显抑制，而敏感种群在双氟磺草胺浓度为 0.8 μM时ALS活性抑制率已近80%。抗性种群G130的I50为 3.584 μM，为敏感种群的137.8倍(表3)

3 讨 论

自双氟磺草胺2001年进入中国市场(以普瑞麦Prumus在我国获得临时登记)一度被作为苯磺隆的替代药剂[24]，近年来被广泛使用于冬小麦田防除阔叶杂草。张朝贤等[25]发现，ALS 抑制剂类除草剂连续重复使用3～5年以上，极易导致杂草对该类除草剂产生抗性。双氟磺草胺作为典型的ALS抑制剂类除草剂，杂草对该药剂产生抗性足以预见。2014年，马鹏生[26]报道了河南省猪秧秧对双氟磺草胺产生抗性；2018年，Bai等[27]在抗苯磺隆的牛繁缕种群中发现对双氟磺草胺也产生交互抗性。本研究中，G130种群采自连续7年使用双氟磺草胺的麦田，该种群对双氟磺草胺产生了高水平抗性(108.6倍)。

杂草对ALS抑制剂类除草剂抗性的产生主要是由于靶标酶ALS对药剂的敏感性下降造成的。本研究发现，敏感播娘蒿种群(TS)对双氟磺草胺非常敏感，ALS活性受双氟磺草胺抑制较强，增加双氟磺草胺浓度后，ALS活性迅速下降；而抗性播娘蒿种群(G130)ALS对双氟磺草胺的敏感性显著降低，增加双氟磺草胺浓度，ALS活性下降缓慢，其I50为敏感种群的137.8倍，说明播娘蒿靶标酶ALS对双氟磺草胺敏感性降低是其产生抗性的主要原因之一，推测I50值较高是因为该种群存在多种突变。本研究结果与反枝苋对烟嘧磺隆抗性[28]及播娘蒿[29]、荠菜[30]、麦家公[31]等对苯磺隆抗性结果一致。

表2 双氟磺草胺对播娘蒿乙酰乳酸合成酶的抑制活性差异

杂草ALS空间构象因其保守区关键位点氨基酸被代替而发生变化，导致除草剂无法正常结合靶标位点，从而使杂草对除草剂敏感性下降，这是杂草对ALS抑制剂类除草剂产生抗性的分子机理之一。目前，已证实ALS 序列中8个氨基酸被取代后会导致杂草对ALS 抑制剂类除草剂产生不同水平的抗性。本研究在对播娘蒿抗性种群(G130)和敏感种群(TS) ALS 基因的测序后，对比发现G130种群植株存在ALS 区域197位点和574位点氨基酸序列的改变。其中197位点发生了脯氨酸突变为苏氨酸，574位点色氨酸突变为亮氨酸。推测抗性种群(G130)ALS基因两种突变是导致播娘蒿对双氟磺草胺产生抗性的重要原因之一。

崔海兰[32]发现，抗苯磺隆播娘蒿ALS 第197位脯氨酸突变为亮氨酸后，对IMI类、PTB类、TP类药剂产生交互抗性。Deng等[14]报道，抗苯磺隆播娘蒿ALS 第197位脯氨酸突变为苏氨酸或第574位色氨酸突变为亮氨酸时，对TP类除草剂均产生交互抗性。至于抗性种群G130产生两种突变方式是否由双氟磺草胺应用导致的结果，尚无法确定。从以上报道的结果看，苯磺隆抗性播娘蒿种群同时对TP类药剂产生交互抗性，小麦田苯磺隆应用历史较长，苯磺隆导致的播娘蒿抗性种群也可能对双氟磺草胺产生抗性。播娘蒿抗性种群(G130)与苯磺隆等ALS抑制剂是否存在交互抗性，还有待于进一步研究。

对100株抗性种群植株测序发现，197位点突变占33%，574位点突变占40%，同时发生两种突变占27%。Deng等[14]分别对197位点、574位点单一突变的植株喷施TP类药剂发现，在574位点发生单一突变的植株较在197位点发生单一突变的植株存活率高。本研究所测突变类型中以574Leu突变比例最高，这与前人报道一致。推测不同抗性突变的检出频率可能与杂草物种、除草剂应用历史以及抗性杂草的适合度有关[33]。杂草抗药性的产生也与植株对除草剂的吸收、转运、代谢和隔离等非靶标抗性机理相关，该种群是否存在非靶标抗性仍待进一步研究。

综上所述，本研究表明，播娘蒿种群G130对双氟磺草胺产生了高水平抗性，靶标酶基因突变导致ALS 对双氟磺草胺的敏感性下降是G130产生抗性的重要原因之一。为避免或延缓抗药性的发生发展，建议避免连续使用同一作用机理药剂，将不同作用机理药剂科学混用、轮用，做到合理施药；结合农业措施、物理措施等进行综合治理，以延缓抗药性的发生。