新疆小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因 TaBahd-A1等位变异检测及其分布规律

战帅帅，严勇亮，刘鑫源，王丽丽，耿洪伟

(1.新疆农业大学农学院，新疆乌鲁木齐 830052； 2.新疆农业大学生物技术重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052；3.新疆农业科学院农作物品种资源研究所，新疆乌鲁木齐 830091)

小麦是我国主要粮食作物之一。不同传统食品如面条、饺子、馒头等对小麦面粉品质具有不同的要求，品质改良已成为小麦遗传改良的重要内容[1]。阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，AX)是小麦中重要的亲水性非淀粉多糖，虽然含量较低 (2.3%～6.8%)[2]，但可通过阿魏酰阿拉伯木聚糖(feruloyl arabinoxylan，FAX)结构中的阿魏酰基氧化交联形成凝胶网络[3]，进而影响小麦的加工品质(面筋含量、面粉的水分和吸水性)[4]，另外，AX还具有免疫调节[5]、抗氧化[6]、促进膳食[7]和肠道益生菌特异性增殖[8]等生物活性作用。AX的结构和性质对其功能有重要影响，而FAX含量高低是决定小麦AX结构和性质的关键因素[9]。利用功能标记对新疆小麦进行等位变异检测，揭示FAX含量相关基因在不同小麦品种(系)中的遗传变异规律，可为小麦分子育种改良提供一定参考。

有关FAX的研究已由性能方面逐步向基因挖掘层面深入研究[9]。国内外研究指出，小麦FAX由植物特有的BAHD家族的阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶(arabinoxylan feruloyl transferase，AFT)催化合成[9]。张岐军等[10]认为基因型是影响水溶性阿拉伯木聚糖含量的主要因素，基因型和环境互作影响不显著。目前，利用不同小麦群体对AX和FAX含量性状进行全基因连锁分析、全基因组关联分析(genome-wide association studies，GWAS)已有相关报道[11]。 Nguyen等[12]利用双单倍体(doubled haploid，DH)群体在2A和4D染色体上检测到与AX含量相关的两个主要的数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)。吕文娟等[13]利用周麦16/藁城8901的176个重组自交系(recombinant inbred lines，RIL)群体，使用90 K的iSelect基因芯片对FAX含量进行全基因组连锁分析，检测到5个在多个环境下稳定表达的QTL，分别位于2AS、2BS、2DL、3AS和6AS染色体上，其中在3A染色体上发现的QFax.xjau-3AS上可解释最大的表型变异(18.2%)。Zhan等[14]分别以166份黄淮冬麦区和90份北部冬麦区品种(系)为材料，分别利用小麦90 K SNP 芯片的18 189 和13 198 个高质量SNP标记，对FAX含量进行GWAS，其中，在黄淮冬麦区材料中共检测到83个与FAX含量显著相关的SNP标记(P<0.001)，在北部冬麦区材料中共检测到33个与FAX含量显著相关的SNP标记(P<0.001)，并利用距QFax.xjau-3AS最近的SNP标记进行检测，验证了小麦第3同源染色体组上存在调控FAX含量的主效 基因。

迄今为止，大麦(HordeumvulgareL.)、水稻(OryzasativaL.)和普通小麦(TriticumaestivumL.)的AFT基因已被克隆[15-16]。战帅帅等[16]应用FR846233为探针，克隆了3A染色体上的TaBahd-A1基因，并基于该基因的SNP位点，开发了2个互补显性标记AFTA2和AFTB2，用于分辨等位变异TaBahd-A1a(与高FAX含量相关)和TaBahd-A1b(与低FAX含量相关)。Geng等(待发表)从4个RIL群体的8个亲本中发现了TaBahd-A1基因的新的等位变异类型TaBahd-A1c，并开发了功能标记AFTC8，用于分辨等位变异TaBahd-A1c(与高FAX含量相关)。

目前尚无新疆小麦FAX含量相关基因等位变异检测的报道。因此，本研究利用TaBahd-A1基因位点已开发的功能标记AFTA2、AFTB2和AFTC8对新疆冬小麦进行等位变异分子检测，明确TaBahd-A1位点的等位变异在新疆冬小麦材料中的分布，以期为新疆小麦品质遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为124份新疆小麦品种(系)，其中98份为冬小麦品种(系)，包含自育品种(系)43份，引进品种(系)38份，地方品种17份；26份为新疆春小麦品种(系)，全部为自育品种(系)。上述材料包含了新疆麦区不同时期主要种植品种(系)和骨干亲本及选育的品种，具有很好的代表性。2018-2019年度种植于新疆玛纳斯试验基地，随机区组设计，3次重复，3行区，行长2 m，行距25 cm，田间管理按照当地常规栽培管理方式，小麦田间长势良好，正常收获，无倒伏和穗发芽现象。全部材料均由新疆农业大学农学院小麦遗传育种课题组收集。

1.2 小麦基因组DNA的提取

参考Zhan等[14]的方法，采取酚氯仿抽提法进行小麦DNA提取，试剂取用量略加改良。

1.3 PCR扩增与检测

1.3.1 检测引物

利用战帅帅等[16]开发的显性互补标记AFTA2、AFTB2及Geng等(待发表)开发的标记AFTC8对新疆小麦材料3A染色体上TaBahd-A1位点进行等位变异检测。PCR扩增的目标片段大小以及引物序列等相关信息详见表1，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 TaBahd-A1基因等位变异引物序列、扩增片段

1.3.2 PCR反应体系及扩增程序

以小麦基因组DNA为模板，在MJ Research PTC-200 PCR仪上进行PCR，PCR扩增体系为25 μL，包括Taq DNA polymerase(2.5 U· μL-1)0.25 μL，上、下游引物(4 μmol·L-1)各1.0 μL，dNTP(2.5 μmol·L-1)1 μL，10×Loading Buffer 2.5 μL，然后用水补充至25 μL。所有试剂均购于北京天根生化科技公司。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，退火温度如表1所示，退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR扩增产物的电泳检测

利用1.2%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，电泳时所采用的缓冲液体系为 1×TAE溶液，120 V电压电泳30～40 min， 0.5%的溴化乙锭(EB)染色15 min，蒸馏水漂洗后平铺在VILBER LOURMAT凝胶成像系统上，拍照并保存到计算机中。

1.4 统计方法

对124份新疆小麦品种进行编号，根据每个小麦品种(系)3粒种子基因组DNA的检测结果，判断该品种的TaBahd-A1位点等位变异类型，选择PCR产物条带明晰、单一且符合目标条带位置的结果进行统计，若结果不一致，需重新提取该品种的其余籽粒DNA，并重新检测。

2 结果与分析

2.1 新疆小麦品种的 TaBahd-A1等位变异类型

AFTB2在携带等位变异TaBahd-A1b的材料(阿克库孜盖、白冬麦、热衣木夏、早洋麦和新冬22号)中能扩增出438 bp的片段，而在其他材料中不能扩增出该片段(图1)。AFTA2在携带等位变异TaBahd-A1a的材料(纳瓦提然、绥来小红冬麦、红旗1号、新冬41号和新冬5号)中能扩增出692 bp的片段，而在其他材料中不能扩增出该片段(图2)。AFTC8在携带等位变异TaBahd-A1c的材料(北京7号、拉瓦得朗、新冬17号、新冬20号、新春22、伊农16、昌冬5号和喀冬4号)中能扩增出782 bp的片段，而在其他材料中不能扩增出该片段(图3)。

M：Marker DL2000；1：阿克库孜盖；2：白冬麦；3：热衣木夏；4：早洋麦；5：新冬22号；6：纳瓦提然；7：绥来小红冬麦；8：红旗1号；9：新冬41号；10：新冬5号。下同。

图2 功能标记AFTA2对10种材料的多态性检测

M：Marker DL 2000；1：北京6号；2：北京7号；3：新冬15；4：拉瓦得朗；5：新冬17号；6：新冬20号；7：新春22；8：伊农16；9：昌冬5号；10：喀冬4号。

2.2 不同类型新疆小麦品种中 TaBahd-A1基因等位变异的分布频率

通过对TaBahd-A1基因等位变异在冬小麦品种(系)和春小麦品种(系)的频率分布进行统计分析，结果(表2～4)发现，124份新疆小麦品种(系)中，17份材料携带与高FAX含量相关的TaBahd-A1a等位变异基因，占13.7%;71份材料携带与低FAX含量相关的TaBahd-A1b等位变异基因，占57.2%；36份材料携带与高FAX含量相关的TaBahd-A1c等位变异基因，占29.1%。98份冬小麦品种(系)中，携带TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位变异的材料占比分别为12.2%和26.5%；携带TaBahd-A1b等位变异的材料占比61.3%。在26份新疆春小麦品种(系)中，携带TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位变异的材料占比分别为 19.2%和42.3%；携带TaBahd-A1b等位变异的材料占比38.4%。在不同类型冬小麦品种(系)中，TaBahd-A1a等位变异的分布频率表现为引进品种(系)>地方品种>自育品种(系)，TaBahd-A1b等位变异的分布频率表现为自育品种(系)>地方品种>引进品种(系)，TaBahd-A1c等位变异的分布频率表现为自育品种(系)>引进品种(系)>地方品种。

表2 新疆春小麦品种(系)的 TaBahd-A1基因型

3 讨 论

3.1 功能标记的选择

选用快速、准确、经济的分子标记是加速小麦品质改良的有效手段[17]。近几年功能标记在小麦品质[18]、穗发芽[19]、产量[20]、抗旱[21]等方面作为辅助分子育种的有效手段，已逐渐成为研究热点。战帅帅等[16]选用与FAX含量相关的基因特异性分子标记AFTA2和AFTB2，利用中国春缺体-四体系将其定位于3A染色体上，并利用功能标记AFTA2 和 AFTB2对253份国内外冬小麦品种(系)材料进行检测，表明不同基因型间FAX含量的差异达到显著水平(P<0.05)，验证了标记的实用性[16]。而中国春缺体-四体系是小麦遗传研究学珍贵的科研资源，过去十几年时间内，定位了许多基因的染色体物理位置[22]。Hessler等[22]将硬粒小麦的LOX基因定位于4BS染色体上。Geng等[23]将普通小麦TaPod-D1基因开发的功能标记定位于7D染色体上。同样，Geng等(待发表)将开发的标记AFTC8定位于3AL染色体上，用于新等位变异TaBahd-A1c的检测。FAX含量是由多基因控制的复杂数量性状，吕文娟等[13]研究表明，位于3A染色体上的QFax.xjau-3AS可解释的表型变异最大，因此，本研究选用此位点所开发的功能标记对新疆小麦品种(系)进行等位变异检测，为高面筋含量新疆小麦品种的选育提供一定依据。下一步将继续挖掘3B、3D染色体上的相关功能标记，通过多基因分子标记组合检测，提高辅助育种选择的准确性。

表3 新疆冬小麦品种(系)的 TaBahd-A1基因型

(续表3 Continued table 3)

表4 新疆小麦品种 TaBahd-A1基因等位变异检测及分布规律

3.2 不同类型新疆小麦品种中 TaBahd-A1等位变异的分布规律

本研究发现，98份新疆冬小麦品种(系)中，携带与高FAX含量相关的等位变异类型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分别为12.2%和26.5%，而携带与低FAX含量相关的等位变异TaBahd-A1b的材料有60份，占 61.3%，表明新疆冬小麦材料中，TaBahd-A1b型占主导地位，可能是新疆地区对小麦阿拉伯木聚糖关注度不高，FAX含量对小麦品质方面研究起步较晚造成的。本研究发现，26份新疆春小麦品种(系)中，携带与高FAX含量相关的等位变异类型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分别为19.2%和42.3%，而含有与低FAX含量相关的等位变异类型TaBahd-A1b占比为38.4%。白 璐等[24]利用新疆春小麦材料对TaLox-B1位点进行检测，表明早期品种均为优异等位变异的材料，其分布频率远高于晚期品种。因此，推测本研究所使用的春小麦材料可能包含较多的早期品种，是TaBahd-A1c基因型的材料分布频率较高的原因之一。因此，通过选择具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位变异基因的小麦品种(系)，有助于小麦品质性状的遗传改良。

新疆自育和外引品种与地方品种间均存在明显的遗传差异。本研究发现，在不同类型冬小麦品种(系)中，与高FAX含量相关的TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的分布频率表现为引进品种(系)>地方品种>自育品种(系)；与低FAX含量相关的TaBahd-A1b的分布频率表现为自育品种(系)>地方品种>引进品种(系)。这可能与新疆小麦品种(系)的演变有关，早期的地方品种在后期被有选择性的引进品种所取代，引进品种在长期的选育中，逐渐积累具有与高FAX含量相关的优异等位变异。因此，在新疆小麦品种(系)育种中，通过选择具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位变异基因的引进小麦品种(系)，可以选育出高FAX含量的小麦品种。

3.3 不同麦区 TaBahd-A1等位变异的分布规律

新疆冬麦区的小麦与其他冬麦区小麦相比，其优异等位变异TaBahd-A1a的分布频率占比较低。战帅帅等[16]研究表明，在北部冬麦区和黄淮冬麦区，与高FAX含量相关的等位变异TaBahd-A1a占比远高于与低FAX含量相关的等位变异TaBahd-A1b(36%)。新疆地区小麦与其他麦区之间表现出的差异，反映了一定程度的地域特性，可能与其他麦区早期就有针对性地选育强筋、面团流变学特性较好的小麦品种有关。Hao等[25]也指出，对于同一基因组，不同麦区具有不同的选择牵连作用。且FAX含量为多基因控制的数量性状，利用全基因组连锁分析[13]及全基因组关联分析[14]的方法，均在不同染色体上发现有多个有效位点，不同染色体的基因互作及同一染色体基因不同位点的影响都可能导致不同麦区的差异。

此外，本研究仅对新疆冬小麦材料中FAX含量相关位点TaBahd-A1等位变异进行了基因型检测，暂未对其进行FAX含量测定和关联验证。今后，我们将进一步对新疆小麦FAX含量进行检测，并结合基因型进行显著性分析，同时开发其他染色体上与FAX含量相关的功能标记，通过优异等位基因的组合，进一步提高分子标记辅助育种的准确性，进而对小麦品质遗传改良提供参考。