急性腹泻患者的副溶血弧菌毒力及耐药特征分析

佟世胜

副溶血弧菌是一种在各类海产中广泛流行的重要病原菌，人们食用了未熟的水产品，极易引发胃肠道疾病，大多数食源性疾病都由此菌造成，也会引发食物中毒等严重疾病[1-3]，在全球范围内都有其爆发感染的报道。副溶血弧菌感染主要侵犯人体的胃肠道，若有身体有破溃，也会造成伤口感染，严重的可侵入人体循环系统。胃肠道感染副溶血弧菌的患者症状表现为中重度腹泻，伴有恶心、呕吐及腹部绞痛，部分也可出现发热和里急后重[4]。与副溶血弧菌相关的毒力因子有很多，目前临床上较为热点的是有关耐热直接溶血素（thermostable direct he-molysin，TDH）、耐热直接相关溶血素（TDH-related he-molxsin，TRH）和Ⅲ型分泌系统的研究[5]。过去的大量研究已经证实TDH、TRH 和TLH 三种溶血素对副溶血弧菌的致病性的影响，而它们的编码基因已被确定为trh 和tdh 两种[6]。Ⅲ型分泌系统近期受到众多研究者的关注，目前的研究结果表明T3SS1 与细胞毒素有关，T3SS2 与肠毒素有关。本研究通过对68 例急性腹泻患者的副溶血杆菌进行毒力基因检测及耐药性调查，分析其病原特征和耐药特点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）菌株来源：68 例副溶血弧菌分离自2019 年1-10 月本市肠道门诊急性腹泻患者的粪便样本。（2）仪器与试剂：Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司），药敏纸片（英国Oxoid 公司）。DNA Engine PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司）。副溶血弧菌的毒力基因引物由上海生工生物技术有限公司合成。相关培养基和生化试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血弧菌模板DNA 的提取 菌株分离标准参照《细菌性腹泻临床实验室诊断操作指南》，将分离的副溶血菌株移至培养皿中，在恒温37 ℃下培养过夜，在10 000 r/min 下离心5 min，除去上清液，后加入1 mL 生理盐水，并震荡防止细菌成团，重复上述离心工作；后向沉淀中加100 µL无菌蒸馏水重新震荡悬浮后置100 ℃水浴10 min；13 000 r/min 离心10 min，上清即为PCR 扩增所用的模板DNA，置于低温环境保存

1.2.2 毒力基因检测 检测副溶血弧菌tdh、trh、tlh 基因携带情况，检测技术采用单重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。检测T3SS1、T3SS2α 和T3SS2β 基因携带情况，技术选取多重PCR。引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及反应条件，见表1。

表1 副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因携带情况

1.2.3 药物敏感性试验 实验菌株药敏试验选取于CLSI 推荐的Kirby-Bauer 纸片法。菌株转种于血平板于温度35 ℃经过夜培养后，添加0.85%氯化钠溶液将菌液调整到合适浓度，后将菌液涂满于培养基表面，最后在培养基表面覆盖药敏纸片，经恒温孵育17 h 后对抑菌环直径进行测量。选择15 种抗生素进行研究，选用大肠埃希菌进行质控，参照CLSI M45-2016 的弧菌折点标准和CLSI M100-S26E的肠杆菌科折点标准。

1.3 观察指标 副溶血弧菌感染的毒力基因、副溶血弧菌的药物敏感性试验结果。

2 结果

2.1 毒力基因分析 所有研究对象毒力基因tlh 全部显示阳性，其中携带毒力基因tdh 的菌株有67 株，tdh 携带率为98.53%；2 株trh 阳性。65 株tdh（+）trh（-），2 株tdh（+）trh（+），1 株tdh（-）trh（-）。68 株副溶血弧菌均表达了T3SS1 基因，65 株tdh（+）trh（-）的菌株中有64 株表达了T3SS2α基因，2 株tdh（+）trh（+）的菌株中有1 株表达了T3SS2β 基因，其余菌株未发现。见表2。

表2 68株副溶血弧菌T3SS分布 株

2.2 药物敏感性测试结果 副溶血弧菌对碳氢霉烯类抗生素的敏感性最高达100%，所有菌株对氯霉素、强力霉素、复方新诺明和碳氢霉烯类抗菌药物（亚胺培南、美罗培南）敏感；90%以上的菌株对头孢曲松、阿奇霉素和庆大霉素敏感；对氨苄西林耐药率最高为86.8%，磺胺异噁唑耐药率次之为67.6%。见表3。

表3 副溶血弧菌对16种抗生素的耐药情况 例（%）

3 讨论

副溶血弧菌在全世界均广泛存在并流行，是经口引起疾病的重要菌，最主要是途径是使用海产品，进而导致的胃肠炎[7]，在中国食源性疾病监测网报道的细菌性食源性疾病暴发疫情中，副溶血弧菌相关的中毒事件占总数1 060 起的29%[8]，多达308 起。在全球范围内也有其爆发感染的报道。许多城市早年报道曾有感染副溶血弧菌的病例，短短几年时间，感染人数上升至几千人，未得到有效控制[9-10]。Mao等[11]借助文献法推理演算出，因副溶血弧菌引发的食物中毒在中国每年约发生495.1 万人次，继而引发的急性胃肠炎在发达国家中出现率远小于中国，但关于本病产生的医疗费用极高。副溶血弧菌感染人体后引起的相关疾病主要包括腹泻、胃肠炎、伤口感染，严重可致败血症。被报道最多的相关疾病是食源性腹泻。副溶血弧菌产生的毒力因子中，溶血素是目前受到了较多的关注和研究。在临床和环境分离株中同时存在并有显著的种属特异性的基因是tlh 基因，在以前的认知中，tdh 基因编码的TDH或trh 基因编码的TRH 与副溶血弧菌的致病性有相关性。T3SS 由T3SS1 和T3SS2 组成，分别位于染色体1 和染色体2 上，其中T3SS2 由两种亚型组成，分别是T3SS2α 和T3SS2β 两种[12]，根据当前的研究结果可知，T3SS1 与细胞毒素存在联系，T3SS2与肠毒素存在联系。

一般情况下，实验室分离株均可产生“神奈川现象”（kanagawa phenomenon，KP），出现一种特殊的血琼脂上的β-溶血现象，即KP+，这种现象被认为与TDH 相关。红细胞可以被TRH 与TDH溶解，且两者均可以产生小动物致死肠毒素，两者存在着相似的毒性作用。另外，大（chr I）、小（chr Ⅱ）2 条染色体在绝大部分副溶血弧菌中均可以被发现，每条染色体各自毒力基因编码T3SS1 和T3SS2[12]。副溶血弧菌的T3SS 包括分泌装置和效应蛋白，其中分泌装置由多个结构蛋白组成，效应蛋白由分泌装置分泌。T3SS1 的细胞毒性为主要作用，所有副溶血弧菌中均存在；KP+临床分离菌株中发现绝大多数的T3SS2[13]。

TDH 是一种细胞毒素，同时作为一种蛋白质被染色体上的tdh 基因编码，特征是溶血活性、细胞毒性和肠毒素活性[14]。本研究显示，副溶血弧菌毒力基因tlh 全部呈现阳性的数量为68 株，具有显著的种属特异性；毒力基因tdh 阳性的数量为67 株，其携带率为98.5%，为证实副溶血弧菌最主要的致病因子是TDH 提供了证据。trh 基因编码TRH，故可导致红细胞溶解并产生小动物致死肠毒素，与其相近毒性的还有TDH。本研究中，出现2 株基因型表现为tdh（+）trh（+）的菌株，其trh 基因呈阳性，相关研究证据提示tdh（+）trh（+）基因型的感染性强于其他基因型[15]；而tdh（-）trh（-）的基因型在1 株菌株中出现，推测副溶血弧菌菌株中还可能存在除TDH 和TRH 外的独立致病因子，但本结果未排除其他致病性细菌的混合感染导致的患病。业界一致认为，除TDH 与TRH 外，T3SS 同样是潜在的与副溶血弧菌致病性相关的毒力因子[16]。副溶血弧菌的T3SS 包含由的效应蛋白通过Ⅲ型分泌系统分泌到宿主细胞，这一过程对宿主可产生致病性[17]。研究人员认识到副溶血弧菌含有2 套T3SS（T3SS1 和T3SS2），这一发现建立于该菌的全基因组测序[18]。T3SS1 位于染色体1 上，产生的细胞毒性介导细胞的自体吞噬，主要作用于宿主细胞，导致宿主细胞死亡。T3SS2 位于染色体2 的毒力岛上，只存在于KP+的副溶血弧菌中。副溶血弧菌T3SS2 被证明不能同时但可携带tdh、T3SS2α 或trh、T3SS2β 基因。

本研究中，T3SS1 基因表达全部出现在68 株副溶血弧菌中，可借助T3SS1 基因特异性作为副溶血弧菌的鉴定菌株；tdh（+）trh（-）菌株中均携带T3SS2α 基因，菌株数达64 株，这一结果与国内其他相关研究报道的携带T3SS2α 基因的菌株，其携带的毒力基因tdh 也是阳性一致[19]。检测发现仅tdh（+）trh（+）的菌株中存在T3SS2β 基因，表明trh（+）的存在与T3SS2β 的表达存在关联。本研究结果表明，副溶血弧菌对氨苄西林和磺胺异噁唑的耐药率分别达86.8%和67.6%，与蔡彦秋等[20]的研究结果相符，表明本研究分离的副溶血弧菌的耐药性对这2 种抗菌药物比较严重，临床应对这一现象加以关注。本研究中，共24 株副溶血弧菌对链霉素和阿米卡星出现了一定程度的耐药表现，而氯霉素、复方新诺明、强力霉素和碳氢霉烯类抗菌药物（亚胺培南、美洛培南）的对本菌株的杀灭效果为100%。

综上所述，针对感染性腹泻患者，如已确定致病菌为副溶血弧菌，临床在进行抗生素的选择时，应以美罗培南或亚胺培南等碳氢霉烯类抗生素为首选，其次考虑应用头孢曲松为代表的头孢类药物。