急性腹泻患者的副溶血弧菌毒力及耐药特征分析

2020-01-03 01:00佟世胜
中国医学创新 2020年33期
关键词:弧菌毒力耐药

佟世胜

副溶血弧菌是一种在各类海产中广泛流行的重要病原菌,人们食用了未熟的水产品,极易引发胃肠道疾病,大多数食源性疾病都由此菌造成,也会引发食物中毒等严重疾病[1-3],在全球范围内都有其爆发感染的报道。副溶血弧菌感染主要侵犯人体的胃肠道,若有身体有破溃,也会造成伤口感染,严重的可侵入人体循环系统。胃肠道感染副溶血弧菌的患者症状表现为中重度腹泻,伴有恶心、呕吐及腹部绞痛,部分也可出现发热和里急后重[4]。与副溶血弧菌相关的毒力因子有很多,目前临床上较为热点的是有关耐热直接溶血素(thermostable direct he-molysin,TDH)、耐热直接相关溶血素(TDH-related he-molxsin,TRH)和Ⅲ型分泌系统的研究[5]。过去的大量研究已经证实TDH、TRH 和TLH 三种溶血素对副溶血弧菌的致病性的影响,而它们的编码基因已被确定为trh 和tdh 两种[6]。Ⅲ型分泌系统近期受到众多研究者的关注,目前的研究结果表明T3SS1 与细胞毒素有关,T3SS2 与肠毒素有关。本研究通过对68 例急性腹泻患者的副溶血杆菌进行毒力基因检测及耐药性调查,分析其病原特征和耐药特点,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)菌株来源:68 例副溶血弧菌分离自2019 年1-10 月本市肠道门诊急性腹泻患者的粪便样本。(2)仪器与试剂:Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司),药敏纸片(英国Oxoid 公司)。DNA Engine PCR 扩增仪(美国Bio-Rad 公司)。副溶血弧菌的毒力基因引物由上海生工生物技术有限公司合成。相关培养基和生化试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血弧菌模板DNA 的提取 菌株分离标准参照《细菌性腹泻临床实验室诊断操作指南》,将分离的副溶血菌株移至培养皿中,在恒温37 ℃下培养过夜,在10 000 r/min 下离心5 min,除去上清液,后加入1 mL 生理盐水,并震荡防止细菌成团,重复上述离心工作;后向沉淀中加100 µL无菌蒸馏水重新震荡悬浮后置100 ℃水浴10 min;13 000 r/min 离心10 min,上清即为PCR 扩增所用的模板DNA,置于低温环境保存

1.2.2 毒力基因检测 检测副溶血弧菌tdh、trh、tlh 基因携带情况,检测技术采用单重聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)。检测T3SS1、T3SS2α 和T3SS2β 基因携带情况,技术选取多重PCR。引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及反应条件,见表1。

表1 副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因携带情况

1.2.3 药物敏感性试验 实验菌株药敏试验选取于CLSI 推荐的Kirby-Bauer 纸片法。菌株转种于血平板于温度35 ℃经过夜培养后,添加0.85%氯化钠溶液将菌液调整到合适浓度,后将菌液涂满于培养基表面,最后在培养基表面覆盖药敏纸片,经恒温孵育17 h 后对抑菌环直径进行测量。选择15 种抗生素进行研究,选用大肠埃希菌进行质控,参照CLSI M45-2016 的弧菌折点标准和CLSI M100-S26E的肠杆菌科折点标准。

1.3 观察指标 副溶血弧菌感染的毒力基因、副溶血弧菌的药物敏感性试验结果。

2 结果

2.1 毒力基因分析 所有研究对象毒力基因tlh 全部显示阳性,其中携带毒力基因tdh 的菌株有67 株,tdh 携带率为98.53%;2 株trh 阳性。65 株tdh(+)trh(-),2 株tdh(+)trh(+),1 株tdh(-)trh(-)。68 株副溶血弧菌均表达了T3SS1 基因,65 株tdh(+)trh(-)的菌株中有64 株表达了T3SS2α基因,2 株tdh(+)trh(+)的菌株中有1 株表达了T3SS2β 基因,其余菌株未发现。见表2。

表2 68株副溶血弧菌T3SS分布 株

2.2 药物敏感性测试结果 副溶血弧菌对碳氢霉烯类抗生素的敏感性最高达100%,所有菌株对氯霉素、强力霉素、复方新诺明和碳氢霉烯类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南)敏感;90%以上的菌株对头孢曲松、阿奇霉素和庆大霉素敏感;对氨苄西林耐药率最高为86.8%,磺胺异噁唑耐药率次之为67.6%。见表3。

表3 副溶血弧菌对16种抗生素的耐药情况 例(%)

3 讨论

副溶血弧菌在全世界均广泛存在并流行,是经口引起疾病的重要菌,最主要是途径是使用海产品,进而导致的胃肠炎[7],在中国食源性疾病监测网报道的细菌性食源性疾病暴发疫情中,副溶血弧菌相关的中毒事件占总数1 060 起的29%[8],多达308 起。在全球范围内也有其爆发感染的报道。许多城市早年报道曾有感染副溶血弧菌的病例,短短几年时间,感染人数上升至几千人,未得到有效控制[9-10]。Mao等[11]借助文献法推理演算出,因副溶血弧菌引发的食物中毒在中国每年约发生495.1 万人次,继而引发的急性胃肠炎在发达国家中出现率远小于中国,但关于本病产生的医疗费用极高。副溶血弧菌感染人体后引起的相关疾病主要包括腹泻、胃肠炎、伤口感染,严重可致败血症。被报道最多的相关疾病是食源性腹泻。副溶血弧菌产生的毒力因子中,溶血素是目前受到了较多的关注和研究。在临床和环境分离株中同时存在并有显著的种属特异性的基因是tlh 基因,在以前的认知中,tdh 基因编码的TDH或trh 基因编码的TRH 与副溶血弧菌的致病性有相关性。T3SS 由T3SS1 和T3SS2 组成,分别位于染色体1 和染色体2 上,其中T3SS2 由两种亚型组成,分别是T3SS2α 和T3SS2β 两种[12],根据当前的研究结果可知,T3SS1 与细胞毒素存在联系,T3SS2与肠毒素存在联系。

一般情况下,实验室分离株均可产生“神奈川现象”(kanagawa phenomenon,KP),出现一种特殊的血琼脂上的β-溶血现象,即KP+,这种现象被认为与TDH 相关。红细胞可以被TRH 与TDH溶解,且两者均可以产生小动物致死肠毒素,两者存在着相似的毒性作用。另外,大(chr I)、小(chr Ⅱ)2 条染色体在绝大部分副溶血弧菌中均可以被发现,每条染色体各自毒力基因编码T3SS1 和T3SS2[12]。副溶血弧菌的T3SS 包括分泌装置和效应蛋白,其中分泌装置由多个结构蛋白组成,效应蛋白由分泌装置分泌。T3SS1 的细胞毒性为主要作用,所有副溶血弧菌中均存在;KP+临床分离菌株中发现绝大多数的T3SS2[13]。

TDH 是一种细胞毒素,同时作为一种蛋白质被染色体上的tdh 基因编码,特征是溶血活性、细胞毒性和肠毒素活性[14]。本研究显示,副溶血弧菌毒力基因tlh 全部呈现阳性的数量为68 株,具有显著的种属特异性;毒力基因tdh 阳性的数量为67 株,其携带率为98.5%,为证实副溶血弧菌最主要的致病因子是TDH 提供了证据。trh 基因编码TRH,故可导致红细胞溶解并产生小动物致死肠毒素,与其相近毒性的还有TDH。本研究中,出现2 株基因型表现为tdh(+)trh(+)的菌株,其trh 基因呈阳性,相关研究证据提示tdh(+)trh(+)基因型的感染性强于其他基因型[15];而tdh(-)trh(-)的基因型在1 株菌株中出现,推测副溶血弧菌菌株中还可能存在除TDH 和TRH 外的独立致病因子,但本结果未排除其他致病性细菌的混合感染导致的患病。业界一致认为,除TDH 与TRH 外,T3SS 同样是潜在的与副溶血弧菌致病性相关的毒力因子[16]。副溶血弧菌的T3SS 包含由的效应蛋白通过Ⅲ型分泌系统分泌到宿主细胞,这一过程对宿主可产生致病性[17]。研究人员认识到副溶血弧菌含有2 套T3SS(T3SS1 和T3SS2),这一发现建立于该菌的全基因组测序[18]。T3SS1 位于染色体1 上,产生的细胞毒性介导细胞的自体吞噬,主要作用于宿主细胞,导致宿主细胞死亡。T3SS2 位于染色体2 的毒力岛上,只存在于KP+的副溶血弧菌中。副溶血弧菌T3SS2 被证明不能同时但可携带tdh、T3SS2α 或trh、T3SS2β 基因。

本研究中,T3SS1 基因表达全部出现在68 株副溶血弧菌中,可借助T3SS1 基因特异性作为副溶血弧菌的鉴定菌株;tdh(+)trh(-)菌株中均携带T3SS2α 基因,菌株数达64 株,这一结果与国内其他相关研究报道的携带T3SS2α 基因的菌株,其携带的毒力基因tdh 也是阳性一致[19]。检测发现仅tdh(+)trh(+)的菌株中存在T3SS2β 基因,表明trh(+)的存在与T3SS2β 的表达存在关联。本研究结果表明,副溶血弧菌对氨苄西林和磺胺异噁唑的耐药率分别达86.8%和67.6%,与蔡彦秋等[20]的研究结果相符,表明本研究分离的副溶血弧菌的耐药性对这2 种抗菌药物比较严重,临床应对这一现象加以关注。本研究中,共24 株副溶血弧菌对链霉素和阿米卡星出现了一定程度的耐药表现,而氯霉素、复方新诺明、强力霉素和碳氢霉烯类抗菌药物(亚胺培南、美洛培南)的对本菌株的杀灭效果为100%。

综上所述,针对感染性腹泻患者,如已确定致病菌为副溶血弧菌,临床在进行抗生素的选择时,应以美罗培南或亚胺培南等碳氢霉烯类抗生素为首选,其次考虑应用头孢曲松为代表的头孢类药物。

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