纳米银粒子在牙本质树脂粘接材料中抗菌活性的研究*

林苑云 黎江 冯盈

树脂是一种高分子材料，可在室温下快速固化，是口腔科牙体保存与修复治疗中常用的粘接材料。牙本质是树脂修复常见粘接界面，近年随着第七代粘接剂的研发与使用，其与修复体的粘接效果得到明显提升[1]，但受老化等因素影响，部分以树脂粘接处理的牙本质，存在粘接面微渗漏的问题，可导致继发龋，是造成树脂填充或修复失败的重要原因[2]。因此，有必要赋予牙本质树脂粘接材料抗菌特性，以延长修复体使用寿命。纳米银就是将粒径做到纳米级的金属银单质，对多种微生物具有抑制和杀灭作用，是目前广泛使用的无机抗菌剂[3]。文章现对纳米银粒子用于牙本质树脂粘接材料中的体外抗菌效果进行研究，现报道如下。

1 器材与方法

1.1 仪器材料 超净工作台（上海净化设备厂），分析天平（上海浦春），DYHS-70I 恒温恒湿培养箱（厦门德仪），微量加样器（日本Nichikyo），高压蒸汽灭菌锅（日本松下），Vitek 细菌比浊仪（法国梅里埃），牙本质树脂粘接材料（上海齿科材料厂），纳米银粉（平均粒径20 nm），沙氏琼脂培养基（青岛日水生物科技），乳酸杆菌（ATCC393），变形链球菌（ATCC25175），牙龈卟啉单胞菌（ATCC25261），白色念珠菌（ATCC10231），粘性放线菌（ATCC19246），另有SiC 水磨砂纸、PE 膜、麦氏比浊液、培养皿、玻璃板等。

1.2 方法

1.2.1 制备含纳米银粒子牙本质粘接树脂 常温条件下，取适量牙本质粘接树脂材料，分成8 份，分析天平精准称取纳米银粒子，加入其中7 份样本中，避光条件下充分搅拌30 min，使均匀混合，制备成纳米银粒子质量百分比分别为0（未添加）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% 的牙本质粘接树脂试件。将0 的试件设为阴性对照组，7 组不同质量百分比的纳米银粒子牙本质粘接树脂试件依次设为实验1、2、3、4、5、6、7 组。

1.2.2 制备含纳米银粒子牙本质粘接树脂片 含纳米银粒子牙本质粘接树脂制备完成后，取规格为4 mm×4 mm×1 mm 的模具，模具内面以聚乙烯薄膜缠绕，填充满制备的复合树脂，置于玻璃板上水平按压5 min 后取出，完成树脂片制备。砂纸抛光去除树脂片表面层，使大小一致、形状规整，每组各制作15 个树脂片，供3 次检测使用。树脂片24 ℃蒸馏水中浸泡24 h，妥善保存并标记备用，防止混淆。

1.2.3 菌液配置 取各菌种冻干菌试管，滴加沙氏培养液，充分混匀，取2 mL 菌悬液，接种于培养基，37 ℃恒温培养24 h，后以接种环取培养后的菌悬液，连续转接2 次，完成细菌活化。取末次转接后的新鲜细菌培养物，采用麦氏比浊法制成1×105CFU/mL菌悬液，操作全程严格无菌化。

1.2.4 抗菌实验 将试件置于无菌玻璃皿中，取稀释后的各菌悬液，分别滴加在每组试件上，每个试件各滴加0.1 mL，保证试件的各面均浸在菌悬液中，以消毒过的PE 膜覆盖，37 ℃恒温培养24 h，其中白色念珠菌、粘性放线菌需氧培养，变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、乳酸杆菌厌氧培养。培养完成后，玻璃皿中加10 mL 0.9%无菌氯化钠水溶液，上振荡器高频振荡60 s，充分洗脱试件和PE 膜上的细菌。取洗脱液，10 倍递增法稀释至1×10-2，取样100 µL 接种，同法培养24 h。

1.2.5 抗菌率检测 统计各组试件活菌数，检测参照国标4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》相关标准，每组各检测3 次，取平均值。计算各实验组不同浓度纳米银粒子抗菌率，评价抗菌活性。计算公式：抗菌率=（阴性对照试件回收菌数-实验组对照试件回收菌数）/阴性对照试件回收菌数×100%。抗菌率越高，抗菌活性越强。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（）表示，比较采用t 检验；三组及以上的组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t 检验。计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别试件表面菌落数统计 经检测，实验1～7 组试件表面5 种细菌的菌落数均显著低于阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且随着纳米银粒子质量百分比的增加，实验1～7 组试件表面菌落数均呈递减趋势，各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 不同组别试件抗菌率统计 经计算，除实验3组牙龈卟啉单胞菌的抗菌率达90.44%以外，实验1～3 组5 种细菌的抗菌率均未超过90%，抗菌效果一般，但实验2、3 组抗菌率较实验1 组均有改善，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验4 组5 种细菌抗菌率均达90%，抗菌性强。实验5～7 组5 种细菌的抗菌率均超过98%，抗菌性极强，且虽然随着纳米银粒子质量百分比的增加，实验5～7 组的抗菌率有所上升，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 不同组别试件表面菌落数统计[CFU/cm2，（）]

表1 不同组别试件表面菌落数统计[CFU/cm2，（）]

*与阴性对照组比较，P＜0.05。

表2 不同组别试件抗菌率统计[%，（）]

表2 不同组别试件抗菌率统计[%，（）]

*与实验1 组比较，P＜0.05。

3 讨论

银是具有抗菌能力的金属，可以抑制微生物生长繁殖，特别是借助前沿纳米技术将银纳米化所形成的纳米银粒子，目前已被广泛作为无机抗菌剂使用[4-7]。主要抗菌机制：（1）银粒子带有正电荷，可以穿透细菌的细胞壁进入带有负电荷的细胞膜内，两者接触后发生巯基反应，会破坏细菌固有成分，使蛋白质凝固及酶灭活，或使细菌产生功能性障碍，造成细胞分裂增殖能力丧失，从而达到抗菌的效果；（2）银粒子能够与细菌体内的氧代谢酶（-SH）结合，使细菌窒息死亡；（3）银粒子还能通过破坏细菌呼吸系统与物质传输系统、损伤细菌细胞膜、抑制细菌蛋白质等机制发挥杀菌灭菌的作用。而当细菌失去活性后，细胞膜负电荷消失，菌体内的银离子会游离出来，继续与其他活菌结合，重复杀菌活动[8-9]。因此，与传统不稳定的有机灭菌剂相比，银的抗菌效果更为持久，且无任何毒性反应、刺激反应与耐药性，安全无伤害，用于医疗材料领域优势诸多[10-12]。

有研究显示，纳米银粒子抗菌效果极强，可在数分钟内杀死细菌，而且抗菌谱广，对耐药病原菌也具有全面抗菌活性，已知可杀死的细菌种类超过650 种，几乎涵盖临床常见致病菌[13-15]。有学者在研究中证实，质量百分比为0.5%的纳米银粒子即可发挥明显的抑菌效果，可以有效抑制粘接材料细菌生长[16-17]。另有研究显示，将纳米银掺入到树脂粘接材料中，制成质量百分比为0.6%的复合材料，可以明显抑制龋菌生长，且不会对树脂材料的机械性能造成明显影响[18]。本次研究结果显示，实验1～7 组试件表面5 种细菌的菌落数均显著低于阴性对照组（P＜0.05），提示牙本质树脂粘接材料中加入质量百分比为0.5%的纳米银粒子，即可明显抑制细菌产生。从理论上讲，随着纳米银添加比的增高，单位面积树脂材料上银粒子越多，抗菌效果越强，这在本研究中也得到了证实。实验1～7 组随着纳米银质量百分比的增加，抗菌率呈增高趋势，特别是当质量百分数达3.0%时，5 种细菌抗菌率达98.0%，展现出了极强的抗菌活性，且与更高质量百分数的纳米银树脂粘接材料抗菌率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，单从抗菌角度来看，建议将3.0%作为纳米银粒子最佳添加比。不过，树脂材料不同，纳米银粒子的抗菌活性可能存在差异，而且纳米银粒子添加越多，材料成本越高，还可能对材料的硬度、韧性、耐磨性、抗热震性等物理性能产生影响，可能导致生物安全性降低[19-20]。因此，牙本质树脂粘接材料添加纳米银粒子具体适宜的量，应综合考虑抗菌活性、物理性能、材料成本等多因素，以达到最佳性价比。