TCT、HPV-DNA联合P16、Ki67检测在宫颈癌前病变与宫颈癌诊断中的应用研究*

李萱 于海胜 刘颖群 方义湖

宫颈癌发病率仅次于乳腺癌，是妇科临床中常见的恶性肿瘤之一，全球范围内，每年死于宫颈癌约有20 多万女性，而我国每年新发宫颈癌约13 万例，死于宫颈癌约3 万例，危害性极大[1-3]。宫颈癌的发生是一个从异型增生到原位癌，最后发展为浸润性癌的渐进过程，有一个较长的、可逆转的癌前病变期，早期宫颈癌患者5 年存活率高达90%[4-5]。若能让早期准确筛查宫颈癌前病变及宫颈癌，尽早实施针对性的措施，对提高患者生存率及延长生存期至关重要。高危型人乳头瘤病毒DNA（HPV-DNA）、薄层液基细胞学检查（TCT）是早期筛查宫颈癌的有效手段，但存在一定的假阴性率或漏诊率，诊断准确性欠佳。相关研究显示，增殖细胞核抗原Ki67 与肿瘤抑制基因P16 与宫颈癌发生、进展密切相关[6-7]。为此，本研究旨在分析TCT、HPV-DNA 联合P16、Ki67 检测在宫颈癌前病变及宫颈癌诊断中的应用价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014 年12 月-2016 年12 月在本院妇科门诊就诊且自愿接受早期宫颈癌筛查的成年女性1 024 例，年龄18～58 岁，平均（38.21±2.36）岁。受检者因体检、性生活出血、白带异常、阴道不规则出血等就诊，无子宫切除、CIN 及宫颈癌病史且非妊娠期。

1.2 方法

1.2.1 TCT 用特质的细胞毛刷采集宫颈脱落细胞，将宫颈移行带区脱落细胞洗入盛有保存液的小瓶中，离心沉淀处理后，提取细胞，制备成单层细胞涂片，直径为13 mm，随后行固定、巴氏染色，用细胞涂片离心机检测系统检测。以TBS 分级实施细胞学诊断。TCT 诊断结果：无上皮内瘤变（NILM），正常或炎症，非典型鳞状细胞（ASC，包括ASCUS 与ASC-H 两类），低度鳞状上皮内病变（LSIL），高度鳞状上皮内病变（HSIL），鳞状细胞癌（SCC）。其 中，LSIL 即CINⅠ，HSIL 即CINⅡ、CINⅢ。ASC-US 及以上病变定为TCT 结果阳性。

1.2.2 HPV-DNA 用基因芯片法检测标本中HPV基因及其分型，高危型HPV 包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等基因。检测出高危型HPV 为阳性。

1.2.3 阴道镜下病理活检 对HPV-DNA 或TCT 阳性患者，阴道镜下取有白色病变、腺体开口、镶嵌、异型血管等可疑病变进行病理学活检检查，若镜下图像不满意或未发现异常，则常规在移行带3、6、9、12 点四处活检。病理诊断结果包括正常或炎症、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌。

1.2.4 P16、Ki67 在阴道镜下取宫颈活体组织，使用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4 µm，以免疫组化染色法进行P16、Ki67 染色。P16 以细胞浆或/和细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。在400 倍高倍显微镜下，每张切片随机选择5 个视野，计数阳性细胞的百分数，结果取平均值。（-）：阳性细胞为0～5%；（+）：阳性细胞为5%～25%；（++）：阳性细胞为26%～75%；（+++）：阳性细胞＞75%。Ki67 以细胞核棕黄色为阳性，阴性：阳性表达局限于上皮的基底层，（+）：超过基底层10%～25%；（++）：超过26%～75%；（+++）：超过＞75%。

1.3 观察指标 （1）分析HPV-DNA、TCT 检测情况，两项结果有一项为阳性行阴道镜下病理活检，以病理诊断结果为金标准，分析HPV-DNA、TCT单一与联合诊断宫颈病变准确率差异。HPV-DNA、TCT 任意一项为阳性，则联合诊断结果评定为阳性。（2）分析P16、Ki67 表达情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV-DNA、TCT 单一与联合诊断宫颈病变效能 1 024 例女性经HPV-DNA、TCT 检查，各筛出阳性例数178 例（17.38%）、164 例（16.02%），HPV-DNA、TCT 结果有一项为阳性者232 例（22.66%），对232 例患者行阴道镜下病理活检确诊为阳性78 例（7.62%），LSIL 34 例（3.32%），HSIL 37 例（3.61%），宫颈癌7 例（0.68%），其余154例（15.04%）为宫颈炎。TCT 联合HPV-DNA 检查与病理活检结果一致性较高，与HPV-DNA、TCT单一检查相比，差异均有统计学意义（χ2=7.929、7.167，P=0.005、0.007）。见表1。

表1 HPV-DNA、TCT单一与联合诊断宫颈病变结果 例（%）

2.2 P16、Ki67 表达情况 宫颈组织中随着CIN 分期增加，P16、Ki67 阳性表达率逐渐升高，见表2。

表2 P16、Ki67表达情况 例（%）

表2（续）

3 讨论

因宫颈癌早期无典型临床表现，大部分患者被确诊时已进展为中晚期，错失手术治疗最佳时机，预后较差，是造成女性死亡的因素之一[8-10]。宫颈癌发生与宫颈感染HPV 病毒密切相关，高危型HPV 感染是宫颈癌与癌前病变发生的必要先决条件[11-13]。故临床常用HPV-DNA 筛查宫颈癌，但因其检测步骤过于繁琐且重现性欠佳，假阴性较高。TCT 是结合现代计算机技术与物理技术实施诊断的细胞学检测新技术，能使制成的薄层涂片细胞结构更加清晰、成分更为齐全且背景更干净，提升阳性诊断率。但在临床诊断中发现，其漏诊率较高[14-16]。本研究中，TCT 联合HPV-DNA 检查与病理活检结果一致性较高，与HPV-DNA、TCT 单一检查相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示联合诊断可优势互补，提高宫颈病变检出率。

宫颈癌形成、转移、浸润是极为复杂的病变过程，与多种抑癌基因与癌基因的调控、表达和细胞凋亡密切相关[17]。P16 属于细胞周期抑制因子，其表达产物P16 蛋白是CDK6 和CDK4 的抑制剂，能负调控细胞周期，抑制细胞恶变过度增殖[18-19]。但P16基因突变、缺失、启动子高甲基化可诱发Cyclin D1-CDK4/6-pRb-E2F 通路调节功能失控，促使细胞过度增殖，进而导致患者出现肿瘤。Ki67 是一种具有维持细胞增殖作用的抗原，其表达水平可直接反映细胞增殖活性，是判断肿瘤恶性程度和预后的重要指标[20]。本研究结果显示，宫颈组织中随着CIN 分期增加P16、Ki67 阳性表达率逐渐升高，提示P16、Ki67 与宫颈癌的发生、进展密切相关。

综上所述，TCT 联合HPV-DNA 检查可有效鉴别诊断宫颈癌前病变及宫颈癌，且P16、Ki67 与宫颈癌前病变及宫颈癌发生、进展密切相关，可将其作为诊断宫颈病变手段，为早期诊断宫颈癌提供新思路。