抗结核药物的合成及抗菌活性

李 丽，张 焕，曾祥聪，丁 娇，马 峻，祝 宏*

1.武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430205；

2.武汉市金银潭医院，湖北 武汉 430023

杂合技术越来越受到人们的关注，其原理是将不同生物活性物质的药效团部分组合以产生与相应药物相比具有改善的亲和力和功效的新的化合物。且从已经建立的药物中设计和开发药物分子，以期望发现更加有效的新药物［1-3］。例如，罗氏公司利用喹诺酮类药物与β-内酰胺类药物结合的杂合药物ro-23-9424。体外实验表明，ro-23-9424的抗菌谱较广，对喹诺酮类和头孢类药物的耐药菌均有效，特别是对铜绿假单胞菌有较强的作用［4］。

吡嗪酰胺、氧氟沙星是WHO推荐的抗结核药物，具有杀菌力强、选择性高、副作用少的优点［5-6］。水杨酸类药物是应用最早和最普遍解热镇痛抗炎药物［7］。磺胺醋酰是一种广谱抑菌剂［8］。在杂合药物的制备过程中，通过对原有抗结核药物进行结构修饰来改变原来药物对受体的作用方式，增加药物的靶向性，从而改变药物作用于受体的方式，以利于扩大该类药物的整体抗菌作用范围，减少药物耐药性，降低药物毒副作用［9-10］，获得比原有抗结合药物更好的效果等［11-13］。根据以上杂合设计策略，本研究合成了乙酰水杨酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰两种杂合药物，具体合成路线如图1和图2所示。

图1 乙酰水杨酸-吡嗪酰胺的合成路线Fig.1 Synthesis route of acetylsalicylic acid-pyrazinamide

图2 氧氟沙星-磺胺醋酰的合成路线Fig.2 Synthesis route of ofloxacin-sulfacetamide

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

吡嗪酰胺（天津市博迪化工有限公司）；氧氟沙星（宜昌人福药业有限责任公司）；乙酰水杨酸（上海麦克林生化科技有限公司），其余反应所用的试剂均为分析纯，并按要求进行纯化处理。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；RY-1熔点仪；AB204-N型电子天平；ZF7三用紫外分析仪；旋转蒸发器RE-52C；Mercury Plus 400型核磁共振仪；Perkin Elmer型傅里叶红外光谱仪，KBr压片；UltiMate3000戴安高效液相色谱仪；Agilent 6460 LC/MS液质联用仪。

1.2 试验方法

1.2.1 目标化合物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺的合成 称取1 g（0.005 mol）乙酰水杨酸于单口烧瓶中，加入10 mL二氯甲烷，再加入 5 mL（0.025 mol）二氯亚砜，接着滴加2滴N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF），将上述反应瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，室温条件下搅拌，发现有气体产生后再缓慢升温至50℃回流，待不再有气体产生停止，浓缩得到乙酰水杨酸酰氯备用。称取0.5 g（0.004 mol）吡嗪酰胺溶于20 mL氯仿中，再加入1 mL三乙胺，39℃条件下磁力搅拌。将浓缩得到的乙酰水杨酸酰氯用5 mL二氯甲烷稀释，滴入反应瓶中，升温到45℃下回流，用硅胶层析板［silica gel chromatography，TLC；GF254硅胶板，V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=15∶1］监控反应，直至原料吡嗪酰胺消失，减压浓缩得到粗产品。粗产品通过柱色谱法分离［柱色谱中硅胶粒径为70～100 μm；洗脱剂为二氯甲烷-甲醇（体积比20∶1）］，得到乙酰水杨酸-吡嗪酰胺纯品；纯度为98%。

乙酰水杨酸-吡嗪酰胺：浅棕色固体；收率76%；mp：92～95 ℃；IR（ KBr，cm-1）：3 331.55，1 733.96，1 649.15，1 618.32，1 578.68，1 476.52，1 400.55，1 294.12，1 288.35，1 199.95；1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：11.21（s，1H），9.56（s，1H），8.90（d，J=12Hz，1H），8.70（d，J=4 Hz，1H），8.13（d，1H），7.83（d，J=8 Hz，1H），7.43～7.41（m，1H），7.20～7.22（m，1H），2.33（s，3H）；13C NMR（400MHz，CDCl3） δ：169.43，168.63，166.63，151.21，147.57，145.55，144.43，142.55，132.43，129.97，126.50，126.22，122.51，21.10.HRMS-ESI（m/z）calculated for［2M+Na+］：593.14；found：593.20。

1.2.2 目标化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的合成 称取 1 g（0.003 mol）氧氟沙星和 0.6 g（0.003 mol）磺胺醋酰于单口烧瓶中，加入20 mL DMF中，接着加入0.57 g缩合剂二环己基碳二亚胺，将上述反应瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，80℃条件下磁力搅拌。TLC［GF254硅胶板，V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=10∶1］监控反应，直至原料氧氟沙星消失。冷却至室温，析晶，过滤，滤饼在40～50℃下鼓风干燥得到粗产物。粗产物通过柱色谱法分离［柱色谱中硅胶粒径为70～100 μm；洗脱剂为二氯甲烷-甲醇（体积比20∶1）］，得到乙酰水杨酸-吡嗪酰胺纯品；纯度为96%。

氧氟沙星-磺胺醋酰：黄色固体；收率65%；mp： 120～123 ℃ ； IR（KBr，cm-1）：3 841.23，3 695.02，3 252.43，2 926.45，2 793.44，2 325.09，1 972.25，1 649.80，1 540.90，1 470.62，1 447.98，1 148；1H NMR （400 MHz，CDCl3），δ：7.6 6（s，1H），7.6（s，1H），7.5（d，J=12.0，1H），7.24（d，J=3.20，1H），6.96（d，J=4.0，1H），4.19（s，2H），3.35（s，H），2.66（s，3H），2.56（s，2H），2.56（s，3H），2.46（d，J=4.0 HZ，2H），2.36（s，3H）2.56（s，1H），1.46（s，3H）；13C NMR（400MHz，CDCl3）δ：173.52，164.77，156.68，154.13，153.86，139.16，139.11，139.07，131.51，124.43，121.66，121.64，121.59，119.93，104.43，104.19， 118.93，77.05，55.70，55.23，54.14，50.47，49.69，46.31，24.46，18.25；HRMS-ESI（m/z） calculated for［M+1/H2O］：569.18，found：569.30。

2 生物活性测试

为了检测杂合药物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰的生物活性，选择HR37V标准株用于药敏试验，通过氧化还原指示剂显色法检测结核分支杆菌的耐药性，结核分支杆菌在生长过程中会产生NAD（P）H，氧化还原指示剂刃天青，可通过指示剂颜色变化判断药物的敏感性［14］。红色表示耐药（R），蓝色表示敏感（S）。

2.1 测试方法

取目标杂合药物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺和氧氟沙星-磺胺醋酰，用适量的DMF溶解后，配成1 mg·mL-1的含药溶液，进行灭菌处理，再将其用无菌膜密封，放置待用。

1）向无菌96孔板（1～12孔）中每孔加7H9培养基100 μL。第1孔加入一定浓度的含药溶液，对倍连续稀释至第12孔。各孔药物最终质量浓度：乙酰水杨酸、吡嗪酰胺和磺胺醋酰质量浓度为0.48～500 μg·mL-1，乙酰水杨酸-吡嗪酰胺杂合药物质量浓度为 0.48～500 μg·mL-1，氧氟沙星-磺胺醋酰杂合药物质量浓度为 0.48～500 μg·mL-1。

2）加入2滴质量分数为0.5%的Tween-80生理盐水及临床分离的2～3周菌龄的培养物到玻璃磨菌器底部，研磨至乳酪样，用生理盐水稀释成1号麦氏比浊管的浊度（1 mg·mL-1），用7H9培养基稀释后1～8孔每孔接种100 μL。空白孔作为培养基对照。

3）将板用无菌膜密封，放置在湿盒内，37℃培养5 d，第6 d加入过滤除菌的刃天青显色液（0.1 g·L-1）30 μL至第12孔，继续培养24 h，如空白孔（不含药物）变成粉红色，则加同等量的刃天青显色液至其他各孔，24 h后记录颜色变化。颜色从蓝色变为粉色即预示细菌生长。

2.2 测试结果

以不含抗结核药物的培养基作为对照组，观察培养基的颜色随时间的变化，培养基的颜色反映了HR37V标准菌株的生长情况，进一步说明了该药物对结核杆菌的抑菌活性。R为对结核分枝杆菌的耐药，即无活性；S则为对结核分枝杆菌的敏感性，即有活性（该质量浓度单位为μg/mL），培养基能显示蓝色的最低浓度为药物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值［15］，结果见表1。

表1 目标化合物的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activities of target compounds

3 结果与讨论

3.1 化合物的合成

乙酰水杨酸-吡嗪酰胺杂合药物的合成，实质就是酰化反应。该合成过程中，先以乙酰水杨酸作为原料合成乙酰水杨酰氯，在制备酰氯时，加少量DMF作为催化剂，DMF先与SOCl2形成类Vilsmeier的中间体，该中间体被羧酸进攻而形成酰氯，同时放出DMF，循环催化反应，缩短反应时间［16］；在接下来合成酰胺时，先加入缚酸剂三乙胺，再缓慢滴加乙酰水杨酰氯生成酰胺。此路线的设计操作简单，成本低，原料装置易得，条件温和，后处理简单且污染小，可行性高。该杂合药物可以弥补吡嗪酰胺只能在酸性条件下才有活性的弊端［17］，并起到协同的抗结核杆菌的作用。

在设计合成氧氟沙星-磺胺醋酰杂合药物的过程中，我们以磺胺醋酰和氧氟沙星为原料，反应得到席夫碱，让双键电子分散的取代基团更稳定。更重要的是乙酰水杨酸-吡嗪酰胺可以通过一步反应得到，反应条件温和，操作简单易实施，且利用廉价易得的试剂获得目标产物。

3.2 谱图分析

目标化合物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺的红外光谱（infrared spectroscopy，IR）图谱显示（图 3）：3331.55cm-1为N-H伸缩振动吸收峰；而1649.15 cm-1为C=O的伸缩振动吸收峰；1 604.19 cm-1为N-H振动吸收峰；1 400.55 cm-1为C-N的伸缩振动吸收峰，以上都是酰胺键基团的特征吸收峰，据此可初步判断形成了酰胺式结构；化合物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺的1H NMR（CDCl3作溶剂）图谱化学位移δ=11.21处为酰胺键中NH氢吸收峰。

图3 乙酰水杨酸-吡嗪酰胺：（a）红外图谱，（b）核磁共振氢谱Fig.3 Acetylsalicylic acid-pyrazinamide：（a）IR spectrum ，（b）1H NMR spectrum

目标化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的IR图谱（图4）：1649.80 cm-1为席夫碱中C=N键的伸缩振动吸收峰；1715 cm-1为C=O伸缩振动吸收峰，1545.35 cm-1为C=C的伸缩吸收峰；843.79 cm-1处的吸收归属于苯环对二取代的特征吸收；化合物氧氟沙星-磺胺醋酰的1H NMR（CDCl3作溶剂）图谱化学位移δ=7.24为氧氟沙星-磺胺醋酰上与N相连的亚甲基上的氢吸收峰。

图4 氧氟沙星-磺胺醋酰：（a）红外光谱，（b）核磁共振氢谱Fig.4 Ofloxacin-sulfacetamide：（a）IR spectrum，（b）1H NMR spectrum

3.3 目标化合物生物活性测试结果

采用氧化还原指示剂显色法来检测结核分枝杆菌的耐药性，通过指示剂从氧化态到还原态的颜色来判断药物的敏感性。试验结果表明：目标杂合药物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺杂合药物和氧氟沙沙星-磺胺醋酰杂合药物均显示出较好的的杀菌活性，其中杂合药物乙酰水杨酸-吡嗪酰胺具有较乙酰水杨酸、吡嗪酰胺更强的杀菌效果，杂合药物氧氟沙星-磺胺醋酰具有较磺胺醋酰更强的杀菌效果。

4 结 语

本研究结合抗结合药物的研究现状，设计、合成了两个杂合抗结合药物。根据“鸡尾酒疗法”将两个不同靶点的药物通过化学合成的方法连接起来得到2个未见文献报道的新化合物。该反应原料易得，反应收率高，目标化合物经1H NMR、13C NMR、IR及MS等表征确认。药敏试验采用稀释法，结果表明这2个目标杂合物对结核分枝杆菌的抑菌效果很好。利用杂合技术合成新的抗结核药物进行抗菌活性筛选，旨在进一步深入开展以耐药机制为基础的杂合抗结核药物的活性研究提供重要的参考信息。