多香果对生鲜肉制品中N-亚硝胺、生物胺及游离氨基酸含量的影响

朱倩颖 王宗义 丁 轲 陈湘宁 韩 涛*

（1 食品质量与安全北京实验室 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院 北京 102206

2 中国地质环境监测院 北京 100081）

N-亚硝胺是公认的致突变、致畸和致癌的有毒物质[3]。N-亚硝胺常存在于腌制肉制品中。生鲜肉制品和方便调理制品是家庭烹饪中重要的肉制品原材料之一，可通过多种烹饪方法，如蒸、煮、炸、烤、炖等，制作成菜肴、狮子头等精美食物，因方便快捷而深受大众喜爱。以生鲜肉丸为例，其以纯肉为主要原料，通过加入调味料及硝酸盐来显色、增香，后者可使蛋白质产生的胺类与硝酸盐反应生成N-亚硝胺[1-2]。

国内外学者对N-亚硝胺形成的抑制做了一些研究。吴春等[4]通过提取葡萄籽中的花青素，将花青素在模拟胃液条件下加入二甲胺和亚硝酸钠，抑制N-亚硝胺形成，可能是花青素优先与亚硝酸盐反应，减少N-亚硝胺形成的前体物质亚硝酸盐的浓度。花青素属于多酚类物质，广泛存在于植物中，具有抗氧化、抗炎、抑菌的作用[5]。国内外大多研究是添加少量的天然材料，以期减少N-亚硝胺形成，然而存在抑制率低，抑制原理不清等问题。研究生鲜或腌制肉制品中N-亚硝胺的天然抑制剂及探究其抑制原理具有重要意义。

多香果（Pimenta officinalis L.）是含有多酚类物质的香辛料，别名牙买加胡椒、三香子甘椒，主产地牙买加、古巴等中南美洲国家，被称为天然抗氧化剂，其主要成分为丁子香酚（Eugenol），具有强烈芳香味，磨成粉末可用于多种烹饪食品的添香、加味，同时还具有抑菌、消毒、防虫、抗氧化等作用[6]。多香果的安全使用量是670 mg/kg，可作为天然抗氧化剂用于肉制品[7]。目前有关多香果在生鲜或腌制肉制品中对N-亚硝胺形成的影响研究还很欠缺。

本文以肉丸为生鲜肉制品的代表，通过添加不同浓度的多香果，探讨多香果对肉丸中N-亚硝胺、生物胺含量的影响，并探讨多香果对N-亚硝胺生成的影响及与游离氨基酸和生物胺的关系，为提高肉制品的安全性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂及仪器

1.1.1 试验材料 多香果（牙买加进口），淘宝店“老三铺子”；原料肉（猪肉），回龙观龙华园美廉美超市；食盐，中盐北京市盐业有限公司；食糖，北京糖业烟酒有限公司；白酒（52°），北京红星二锅头酒厂；亚硝酸钠，北京化工厂；味精，上海太太乐食品有限公司；黑胡椒、生姜粉，北京吉得利食品有限公司。

1.1.2 主要试剂 二氯甲烷、甲醇、乙腈、丙酮（色谱纯），韩国德山药品工业；NDPA-d14、NDMA、NPIP、NPYR、NMEA、NDPA、NMOR、NDBA、NDEA（1 000 μg/mL，1mL）标准品，美国 o2si公司；NDMA-d6 （1 000 μg/mL，1 mL），美国 Accustandard Inc公司；Sep-Pak AC2固相萃取小柱，美国Waters公司；色胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、组胺、亚精胺、精胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钡、磺基水杨酸、高氯酸、碳酸氢钠、丹磺酰氯、氨水，北京化工厂；0.22 μm有机系一次性微孔滤头，北京八方科技有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 7890B 7000GC-MS/MS，美国Agilent公司；BF2000氮气吹干仪，北京八方世纪科技有限公司；PE20 pH计，梅特勒-托列多（上海）仪器有限公司；H-20R型离心机，北京安必升科技发展有限公司；HH-2恒温水浴锅，金坛市岸头国瑞实验仪器厂；DHP-500恒温培养箱，上海益恒实验仪器有限公司；HDP-25A型固相萃取装置，上海安谱科学仪器有限公司；FSH-2可调高速匀浆机，常洲国华电器有限公司；S-433D全自动氨基酸分析仪，德国赛卡姆公司；HPLC1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 肉制品配方 原料肉（臀尖肉）以1 kg为基础的配方：盐 0.03 kg，糖 0.04 kg，酒 0.025 kg，硝酸钠 0.5×10-3kg，味精 0.003 kg，黑胡椒 0.002 kg，生姜粉 0.003 kg，多香果[8]。

1.2.2 肉丸工艺流程 原料肉→斩拌→调配→制作（直径约5 cm的肉丸）→冷藏（4℃）[8]。

将新鲜原料肉用绞肉机绞碎，使肥瘦均匀，按照1.2.1节中的材料和配比混合于原料肉中，制成5 cm左右肉丸，用保鲜膜包好，放入4℃冰箱中冷藏9 d。

1.2.3 N-亚硝胺的测定 参考夏晓楠等[9-10]的方法。测定得到二甲基亚硝胺（NDMA）、亚硝基吡咯烷（NPYR）、亚硝基哌啶（NPIP）的含量。

1.2.4 生物胺的测定 根据樊晓盼等[11]的方法略有改动，标准储备液的配置：准确称取酪胺（Tyr）、尸 胺 （Cad）、组 胺 （His）、色 胺 （Try）、对苯 乙 胺（Phe）、腐胺（Put）、精胺（Spm）、亚精胺（Spd）标准品50 mg，用高氯酸（0.4 mol/L）定容于棕色容量瓶中（50 mL），配制成1 mg/mL储备液备用。分别取上述储配液，用上述浓度的高氯酸配制成质量浓度分别为 1.0，5.0，10，20，100 μg/mL 的混合标准溶液，4℃黑暗保存。

样品液配制：准确称取5 g左右绞碎肉丸样品于研钵中，加入20 mL上述高氯酸，研磨。离心（4℃，2 500 r/min，10 min），重复提取。上清液用高氯酸定容至50 mL。

衍生化：分别取上述标准溶液和样品溶液1 mL，加入 2 mol/L 的NaOH 200 μL，饱和 NaHCO3300 μL，再加入10 mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，置于4℃水浴黑暗反应30 min，加入100 μL氨水终止反应。用乙腈定容至5 mL，以 4℃，2 500 r/min离心3 min，经0.22 μm的有机过滤膜过滤，上机待测。

色谱条件：色谱柱：2.1 mm，DAD检测器：波长254 nm，流速：0.3 mL/min，进样量：20 μL，柱温：30℃，流动相A：超纯水，流动相B：乙腈。梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 HPLC流动相洗脱梯度Table1 HPLC mobile phase elution gradient

1.2.5 游离氨基酸的测定 根据苗雨田等[12]的方法略有改动，样品制备：取绞碎的肉丸，经组织粉碎机粉碎，搅拌均匀，称取3 g样品，加入30 mL 8%的磺基水杨酸，高速均质，离心20 min（4℃，10 000 r/min），取上清液重复离心，过滤。加5 mL正己烷，10 mL甲醇，充分振荡。用2 mol/L的NaOH和2 mol/L的HCl调pH值至2.2，加水定容至50 mL，过0.22 μm滤膜，取过滤后的上清液测定。全自动氨基酸分析仪法，Li+型离子交换柱：4.6 mm×60 mm；茚三酮流速：0.35 mL/min；缓冲液流速：0.4 mL/min；柱温：57℃；检测波长：λ1=570 nm，λ2=440 nm；标准氨基酸样品：10 nmol/L；进样量：20 nL；129 min上机定量分析。

表2 氨基酸全自动分析仪洗脱梯度Table2 Amino acid automatic analyzer elution gradient

2 试验设计

肉丸制作过程中，依据以上配方，分为4组，每组除多香果含量外，其余成分完全相同。第1组为对照组，不添加多香果；第2组至第4组分别添加0.02%，0.04%，0.08%的多香果。4℃冷藏9 d，每隔1 d测定指标1次，包括各N-亚硝胺、生物胺和游离氨基酸，每个指标每组样品设置3个平行。抑制率按下式计算[13]：

式中，M0——空白组；N-亚硝胺含量；Mt——试验组；N-亚硝胺含量。

3 数据处理与相关性分析

使用Microsoft Excel 2013，计算平均数、标准偏差、抑制率并作图。统计和相关性分析用SAS 9.0软件（SAS公司）进行描述性统计分析，统计学显著性水平和极显著性差异水平分别为0.05和0.01。

4 结果与讨论

4.1 多香果肉丸中N-亚硝胺含量的变化影响

肉丸中3个N-亚硝胺的含量在贮藏期间呈波动性变化（图1），空白组NDMA的含量呈先上升后下降的趋势；NPYR的含量在第9天最高；NPIP含量随着时间延长而逐渐下降。与空白组相比，不同浓度多香果均可降低肉丸中3个N-亚硝胺的含量，NDMA的含量在1～7 d内波动较大，NPYR的含量在第9天最高，NPIP的含量在3～5 d内波动不大，其中多香果浓度对NDMA含量的影响显著 （P＜0.05），NDMA随多香果浓度的升高而降低，多香果浓度对NPIP、NPYR的影响不显著（P＞0.05）。添加 0.08%的多香果，对3个 N-亚硝胺抑制率最高分别为53.29%，86.38%，68.59%，因此，在安全使用范围之内，浓度越高抑制效果可能越好。

4.2 多香果对肉丸中生物胺含量变化的影响

根据图2 HPLC生物胺混标色谱图的出峰时间对肉丸中8个生物胺进行定性分析，根据表3不同生物胺的线性试验结果，对8个生物胺进行了定量。

肉丸中生物胺的含量在贮藏期间呈波动性变化（图3）。与空白组相比，不同浓度多香果降低了肉丸中5个生物胺的含量。添加香辛料可有效抑制肉丸中的生物胺，这与孙钦秀等[14]的研究类似。如图3（a）所示，多香果浓度对Try影响不稳定，在第1，3，9天添加多香果组比空白组中的Try含量显著降低，最大减少率为62.79%，总体上多香果的添加减少了Try的生成。如图3（b）所示，多香果对Phe的影响显著（P＜0.05），贮藏 3～9 d，Phe 含量随多香果浓度的升高而降低，7 d后极显著 （P＜0.01）；空白组第 3，5，7，9 天比第 1 天 Phe 含量分别增加了 47.77，21.25，92.24，69.86 μg/g，且多香果浓度越高，Phe生成量越低，这有可能与生成苯乙胺的前体物质苯丙氨酸有关。如图3（c）所示，空白组的Put含量呈上升趋势，多香果组Put随多香果浓度的升高而降低（P＜0.05），有明显规律；如图3（d）所示，空白组在贮藏期间Spd呈不规律变化，但多香果对其影响总体上具有显著性（P＜0.05），Spd随多香果浓度的升高而降低，基本上是极显著（P＜0.01）。如图3（e）所示，空白组的Spm变化不规律，总体平稳，多香果对其影响不稳定,说明添加多香果对Spm有减少的作用，这可能与产生精胺的前体物质精氨酸有关。

图1 不同多香果添加量肉丸N-亚硝胺含量的变化Fig.1 Changes of N-nitrosamines in different concentrations of allspice

图2 HPLC生物胺混标色谱图Fig.2 The HPLC chromatogram for a standards mixture of biogenic amines

表3 不同生物胺的线性试验结果Table3 Linear test results for different biogenic amines

图3 添加不同浓度多香果后生物胺含量的变化Fig.3 The changes of biogenic amines in different concentrations of allspice powder

4.3 肉丸中生物胺和N-亚硝胺的相关性

表4为空白组生物胺和添加多香果组生物胺与N-亚硝胺的相关性，空白组的Phe与NPIP具有显著相关性（P＜0.01），相关系数为 0.5680；添加多香果组的Phe与NPIP相关性上升且相关系数为 0.6652（P＜0.05），Phe与 NPYR 具有显著负相关性，相关系数为-0.6759 （P＜0.01），Spm 与 NDMA相关性上升且具有显著性（P＜0.05），相关系数为0.4829。空白组与添加多香果组肉丸中生物胺和N-亚硝胺相关性发生了改变。Phe与NPYR和NPIP、Spm与NDMA相关性上升，说明多香果影响了Phe与NPYR、Spm与NDMA之间的关系。原因可能是多香果的添加改变了N-亚硝胺或生物胺产生的途径，需进一步研究。

表4 未添加多香果与添加多香果肉丸中生物胺和N-亚硝胺的相关性Table4 The correlation between N-nitrosamines and biogenic amines in meatballs with or without adding allspice

4.4 添加不同浓度多香果的肉丸中游离氨基酸含量的比较

如表5所示，不同浓度多香果对18种游离氨基酸含量的影响，空白组天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸第3，5，7，9天均比第1天含量低，而添加多香果组各氨基酸在3，5，7，9天比第1天的含量高。贮藏过程中，肉制品中的生物胺是N-亚硝胺形成的前体物质之一[15]，肉丸中的微生物产生催化氨基酸脱羧的脱羧酶，促进生物胺的生成[16]，说明在肉丸中某些游离氨基酸有可能转化成了相应的生物胺，为N-亚硝胺的生成创造了前体物质。

由图3和表5可知，游离氨基酸含量减少，生物胺含量升高，表明游离氨基酸部分生成了生物胺；其中苯丙氨酸是形成Phe的前体物质，空白组苯乙胺含量升高，苯丙氨酸含量降低，加入多香果组苯丙氨酸含量比第1天升高，说明多香果抑制了苯丙氨酸形成Phe；精氨酸是形成Spm的前体物质，空白组精胺含量升高，精氨酸含量降低，可能是精氨酸形成了精胺；而且在贮藏期间加入多香果组Spm含量减少，而精氨酸含量升高，说明多香果抑制了Spm的生成。

肉制品中的胺类物质主要是由酶和细菌分解肉中的蛋白质、糖、脂肪生成的[17-18]。邢必亮等[19]研究认为生物胺总含量与微生物代谢密切相关，并提出生物胺的减少可有效减少N-亚硝胺的生成。在食品中亚精胺和腐胺与亚硝酸盐生成NDMA，亚精胺和尸胺与亚硝酸盐反应生成NPIP[20]。脯氨酸含量与NPYR的生成有关[21]。肉制品中主要成分是蛋白质，在微生物作用下蛋白质能分解出大量的游离氨基酸[22]。大量生物胺对人体有害，腌制肉制品中含有丰富的蛋白质和大量亚硝酸盐，会生成N-亚硝胺[23]。常见的几种生物胺有Tyr、Spm、Spd、Cad、Put、Phe、Try、His[24]。Kim等[25]对意大利辣香肠进行了辐照，检测其中生物胺和pH值水平，发现经过辐照的样品乳酸菌的增长有所下降，阻止了pH值的下降；γ射线可有效减少6种生物胺（Tyr、Spm、Spd、Cad、Put、Phe）的生成，同时与 pH值的下降缓慢有一定相关性，从而减小N-亚硝胺的生成。卢士玲等[26]筛选了能产生生物胺氧化酶的微生物，可耐糖、盐和亚硝酸盐，分离到3株产生物胺氧化酶菌，符合肉品发酵剂标准且生长能力强、产酸能力差、可抑制产生物胺优势菌的作用，可通过减少生物胺的含量来减少N-亚硝胺的生成。本研究选择多香果用于肉丸的调味，既不会影响亚硝酸盐的作用，又能减少N-亚硝胺的生成。

生物胺和游离氨基酸与肉制品的表面红度有关，原因可能与含氮化合物对基质环境酸碱度的变化有关[27]。蛋白质的降解提高了肽和游离氨基酸的含量，提供了胺类产生的前体物质[28]。生物胺是一种含氮化合物，具有生物活性。根据食品中生物胺来源的不同，将其合成途径分为两种：其一是内源性生物胺，属于脂肪族的生物胺，是由发酵或酮的转氨作用生成；其二是由游离氨基酸脱羧产生的胺，即在微生物的氨基酸脱羧酶作用下蛋白质分解出的游离氨基酸脱羧生成的生物胺。一般来说，肉制品中的生物胺大多是由具有氨基酸脱羧酶作用的微生物使氨基酸脱去羧基而生成[29]。多香果减少生物胺的含量可能是其减少了氨基酸到生物胺的合成几率。

表5 不同浓度多香果对肉丸中18种游离氨基酸含量的影响（μg/g）Table5 Effects of different concentrations of allspice on 18 free amino acids in meatballs （μg/g）

（续表5）

5 结论

多香果对冷鲜肉制品中NDMA、NPIP、NPYR含量总体上具有显著的影响，随多香果添加浓度的升高而含量降低，添加0.04%和0.08%多香果的抑制效果较好。多香果对Phe、Put、Spd总体上也具显著抑制效果；空白组苯丙氨酸含量降低，添加多香果组含量升高。未添加多香果空白组与添加多香果组生物胺和N-亚硝胺相关性发生了改变，Phe与NPIP和NPYR相关性上升，Spd与NDMA的相关性上升。