TGF-β2表达水平与肺腺癌患者预后的关系

赵丽 章淑芳 周杨 范丽丹 青艳 张莉涵

肺癌发病率及死亡率均位于恶性肿瘤第一位，全球数据显示，每年因肺癌死亡患者约150万人，死亡率高达25%以上[1]。肺癌依据其病理类型分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌患者占总数85%左右[2]。非小细胞肺癌包括大细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌等。肺腺癌(Lung adenocarcinoma ,LAD)的发生率占肺癌总数的30～35%[3]，每年全球因LAD死亡人数约50万人。虽然ALK、EGFR-TKI等靶向药物给这些敏感基因突变的LAD患者带来生存获益，但是对于无敏感基因突变的进展期LAD患者生存时间仍然较低，因此仍需要发现更多有效的治疗靶点，使进展期LAD患者能有更多有效的治疗方案，延长患者的生存时间。

Oncomine数据库是目前的癌症相关基因数据库，该数据库包含GEO、TCGA、癌症基因芯片及已发表的研究数据，并整合数据挖掘平台，能在线进行基因差异性表达及预后等分析。该数据库已经有超过715个基因表达数据,86733个癌症组织和正常组织基因表达数据。利用该数据库能筛选出常见肿瘤与正常组织中差异表达基因，并且该数据库中还包括转移、病例类型、分期及生存时间等，因此对Oncomine充分应用能初步挖掘出某癌症的相关基因，不仅可作为后期实验研究的数据支持，还能节约研究时间及经费。Kaplan-meier Plotter数据库包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌相关mRNA和乳腺癌相关miRNA与预后的分析。

转化生长因子-β(Transforming growth factor‐β，TGF-β)是一种参与细胞多种生物学过程的细胞因子，其主要作用于内皮细胞，参与内皮细胞增殖、凋亡、弥散以及血管内皮形成等(10.1038/cr.2008.326)。TGF-β有三种分子亚型包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，TGF-β蛋白受体有两种类型激酶受体(TGFβRI、TGFβRⅡ)，通常情况下TGFβRⅡ受体与其配体结合后使TGFβRI 磷酸化，进而激活下游信号通路，例如ALK、Smad2/3等[4]。研究显示TGF-β1主要作用于血管内皮生长因子，促进血管出芽诱导血管生成[5]，目前关于TGF-β2的认识尚缺乏，有学者认为TGF-β2能降低血管内皮生长因子-2的表达，抑制血管内皮细胞生长[4]，不仅如此，TGF-β2还可能与血管内皮细胞迁移有关。研究发现TGF-β2通过上调SNAIL、锌指转录因子，促进内皮细胞间质转化(Endothelial-mesenchymal transition , EndMT)，EndMT过程与上皮间质转化(EMT)密切相关，而EMT是肿瘤细胞发生转移的重要机制，因此猜测TGF-β2可能与肿瘤的发生发展相关，本研究将通过Oncomine数据库筛选与肺腺癌相关的基因，并结合Kaplan-meier Plotter计算TGF-β2与肺腺癌生存时间的相关性，旨在了解TGF-β2与肺腺癌预后的关系，为肺腺癌治疗靶点提供新选择。

资料与方法

一、数据来源与提取

本研究首先在Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html )数据库中用以下检索词进行检索：“Cancer type:lung adenocarcinoma cancer”；“Gene：TGF-β2”；“Date type：All”；Analysis type：Cancer vs Normal Analysis；临界值设定为：P value<0.05，fold change>2，gene rank=all。再检索Oncomine数据库中TGF-β2与肺腺癌患者生存时间相关性数据，对数据进行提取，整合，结合Kaplan-meier Plotter(https://www.kmplot.com.analysis)数据库进行生存分析。Kaplan-meier Plotter数据库检索条件为：Cancer：lung cancer，Pathological type：adenocarcinoma；Gene：TGF-β2；Split patients by:Auto select best cutoff;Survival：OS；Follow up threshold：All。总生存时间(overall survival,OS)定义为入组观察至任何原因所致死亡时间。

二、统计方法

本研究采用Kaplan-Meier Plotter数据库和SPSS 23．0进行数据分析。采用均数±标准差(x±s)描述TGF-β2基因的表达量，其在正常组织与肺腺癌组织的差异分析采用独立样本t检验。采用Kaplan—Meier法分析TGF-β2表达与肺腺癌预后的关系，组间比较用Log-rank检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TGF-β2在实体肿瘤中表达结果

Oncomine数据库中关于TGF-β2在恶性肿瘤与正常组织表达量的研究有456个，其中44个研究中TGF-β2在肿瘤组织中表达显著上升，34个研究结果显示TGF-β2表达下降，5个肺癌的研究数据显示TGF-β2在肿瘤组织中表达降低(见图1)。

图1 Oncomine数据库中TGF-β2在肿瘤中表达差异

利用Oncomine数据库进行荟萃分析发现TGF-β2在肺癌中差异性表达，且位于所有差异基因第1537位，P=1.25E-8(见图2)。分别提取5项研究原始数据汇总分析，结果显示，TGF-β2在正常肺组织中表达水平为0.151±0.21，肺癌组织中表达量为-2.031±0.32，对比正常肺组织，TGF-β2基因在肺癌组织中表达降低P<0.0001(见图3)。剔除非腺癌研究数据，TGF-β2在正常肺组织与肺腺癌组织中表达量分别为0.597±0.17、-1.529±0.29，肺腺癌组织中TGF-β2表达显著降低P<0.0001(见图4)，Oncomine数据库进行荟萃分析结果显示TGF-β2位于肺腺癌差异基因排序的第1592位，P=0.007(见图5)。

图2 Oncomine数据库中TGF-β2在肺癌组织表达差异

图3 TGF-β2在肺癌和正常肺组织中表达差异

二、TGF-β2在肺腺癌中表达差异

结合4项研究箱图数据显示：TGF-β2在肿瘤组织中表达低于正常肺组织(见图6)。

三、TGF-β2表达与肺腺癌预后的关系

为了进一步研究TGF-β2表达是否影响肺腺癌患者生存时间，我们将Oncomine数据库中Beer DG[6]等人研究的生存时间的数据进行收集、整理(提取的原始数据见附录1)，该研究总纳入85例肺腺癌患者，TGF-β2表达中位表达量为-2.59，我们设定为表达量高于中位数为高表达，其中高表达患者43例，低表达42例；中位随访时间为30.6m(2.4～110m)。统计分析显示TGF-β2高表达患者生存时间更长(HR=0.43,95%CI:0.21～0.89,P=0.02)(见图7)。然后我们从Kaplan-meier Plotter数据中提取TGF-β2与患者总生存时间的关系，对TGF-β2与肺腺癌患者生存时间进行统计分析，并绘制生存曲线图，结果显示TGF-β2高表达的肺癌患者OS略优于低表达患者(HR=0.83,95%CI:0.73～0.94,P=0.0029)，且这种生存优势在肺腺癌患者中更加明显(HR=0.46,95%CI:0.34～0.61,P<0.0001)(见图8)。

图4 TGF-β2在肺腺癌和正常肺组织中表达差异

图5 Oncomine数据库中TGF-β2在肺腺癌中表达差异

图6 TGF-β2在肺腺癌与正常组织表达差异

图7 TGF-β2表达量与肺腺癌患者预后的关系

讨 论

一直以来，肺癌的发生率及死亡率居高不下，严重威胁人们的生命健康，我国每年新增肺癌病例将超过100万人，发病人数位居世界首位[7]，肺腺癌更是肺癌中主要的病理类型。尽管EGFR、ALK等基因突变的肺腺癌患者能从靶向药物中获益，但是仅有70%～80%肺腺癌患者有敏感基因突变，仍有一部分无驱动基因或敏感基因靶向治疗耐药的患者预后较差，总体来说，我国肺癌患者5年OS仅10%～15%，因此仍需要积极探索新的分子标志物及治疗靶点。

TGF-β家族具有复杂的生物学功能，包括细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答及损伤修复等过程。研究数据发现TGF-β对血管的生成有至关重要的作用，主要体现在以下方面：1)TGF-β诱导免疫细胞、纤维母细胞等聚集，后者释放出大量促进血管生成的细胞因子；2)TGF-β1直接诱导成纤维细胞表型发生改变，促进血管内皮生长因子表达；3)TGF-β能与GATA 6启动子结合，进而促进血管内皮细胞功能[8]。TGF-β家族配体与受体结合后(TGF-β I型受体及Ⅱ型受体)，激活信号通路发挥生物学功能。但是有研究报道TGF-β2与血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等一起促进血管生成，进而参与眼部新生血管性疾病的发生[9]。McDowell 等[10]发现TGF-β2能激活Smad信号通路诱导细胞外基质重塑改变细胞骨架，同时诱导细胞外基质相关蛋白表达水平。不仅如此，TGF-β2还可能与上皮细胞增生和上皮间质转化相关：经TGF-β2刺激后晶状体上皮细胞增生受到明显抑制，随着TGF-β2浓度及时间的增加其抑制作用更加明显[11]。TGF-β2还能激活Notch信号通路，进而诱导视网膜色素上皮细胞发生间质转化[12]。

图8 KMP数据库中TGF-β2表达水平与肺癌患者OS的关系

上皮间质转化与肿瘤的发生发展密切相关，因而猜想TGF-β2可能在肿瘤中发挥重要的生物学功能，但TGF-β2对肿瘤的作用存在较大争议，研究发现TGF-β2与高级别胶质瘤发展相关，最初认为其作为胶质母细胞来源的T细胞抑制因子，与胶质母细胞瘤患者免疫抑制相关，因此TGF-β2高表达胶质瘤患者疾病分期更晚及预后较差[13]，同样，张东勇等[14]发现在脑胶质瘤干细胞中TGF-β2表达水平明显升高，沉默其表达能显著降低脑胶质瘤干细胞的侵袭能力，因此他们认为TGF-β2高表达水平可能是脑胶质瘤患者不良预后的危险因素。杨秀华等[15]采用免疫组化检测30例外阴癌患者组织TGF-β2表达水平，他们发现TGF-β2在肿瘤组织中表达水平显著高于正常组织，且高表达TGF-β2患者更易发生淋巴结转移。而我们首先检索Oncomine数据库中TGF-β2在实体肿瘤中表达水平，包括456个研究数据，其中表达升高的有44个研究，表达降低有34项研究，对比正常肺组织，5项研究结果显示肺癌组织中TGF-β2表达显著下降，无表达上升的研究数据，进一步筛选肺腺癌数据支持TGF-β2在肺腺癌组织中表达明显下调。为了进一步探索TGF-β2表达水平与患者预后的关系，我们结合Kaplan—Meier Plotte数据库，结果发现TGF-β2低表达肺癌患者总生存时间更短，这一差异在肺腺癌患者中更加显著，因此TGF-β2低表达是肺腺癌患者不良预后的危险因素。

综上所述，TGF-β2在肺腺癌组织中表达显著降低，且其低表达患者预后较差，故TGF-β2有望成为肺腺癌患者评估预后的分子标志物，甚至作为新的药物治疗靶点，给肺腺癌患者提供新的治疗手段。虽然本研究利用大数据平台进行分析，避免了个别小样本研究数据的偏移，但是缺乏机制研究，TGF-β2是如何影响肺腺癌细胞生物学行为尚不清楚，因此仍需进一步探索。