寒冷对雌性C57BL/6小鼠动情周期的影响*

赵 海， 李 曦， 张 莉， 武 帅， 张永强， 李 军， 张格祥， 杨丹凤△

(1. 兰州大学公共卫生学院， 甘肃 兰州 730000； 2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 300050； 3. 中国人民解放军32110部队卫生连， 黑龙江 黑河 164300)

舒适的温度对于人体维持健康至关重要，极端环境会影响人类健康。寒冷刺激会影响人类心血管系统、内分泌系统、免疫系统和生殖系统[1-3]，已有研究表明冷环境造成人体诸多不适，并导致较高的住院率[4, 5]。有研究表明寒冷可以对雌性大鼠动情周期造成影响[6]，但寒冷影响动情周期的研究依然较少，机制尚不清楚。因此，建立寒冷所致动情周期紊乱模型对于研究动情周期健康显得尤为重要。本研究通过建立寒冷对C57BL/6雌性小鼠动情周期的影响的模型，初步探讨其可能的机制，为预防寒冷可能带来的生殖伤害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级健康雌性C57BL/6小鼠12只，体重(17～20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。饲养温度(23±1)℃，12 h/12 h昼夜交替，自由摄食摄水。

1.2 实验器材

微量加样器、载玻片、生理盐水、95%乙醇、HE染液、4%水合氯醛溶液、ELISA试剂盒(英国Biorbyt公司)、酶标仪(SpectraMax M5)、低温离心机(Centrifuge 5417R)。

1.3 动物分组与处理

阴道细胞学涂片法观察每只小鼠的动情状况，一周后将动情周期均正常的12只小鼠随机分为对照组、低温组各6只。每两天称量一次体重。将低温组小鼠每笼(460 mm×300 mm×160 mm)两只放入(4±0.5)℃无风的低温舱中，每日4 h(10:30～14:30)。将对照组小鼠用同样的方法置于常温动物房饲养。连续冷暴露2周，全部于动情间期(涂片中全部是白细胞)处死，取子宫和卵巢置于-80℃冰箱，血液经心脏取血后离心机3 000 r/min离心15 min后吸取血清分装后置于-80℃冰箱。ELISA试剂盒检测血清性激素水平，子宫和卵巢做病理分析。

1.4 动情周期观察

阴道细胞学检查[6]。每日上午9点，用移液枪吸取适量生理盐水后打入小鼠阴道并抽吸数次，涂于载玻片一端，晾干后用95%乙醇固定15 min，HE染色15 min后通过光学显微镜观察细胞形态，判断每只小鼠所处的动情周期。

1.5 脏器系数的计算

1.6 性激素水平的测定

用酶联免疫吸附测定法检测每只小鼠血清雌二醇(estradiol, E2)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)、孕酮(progesterone, P)和催乳素(prolactin, Prl)水平，严格按照说明书操作。

1.7 组织病理学检查

将剔除周围脂肪及结缔组织的子宫和卵巢立即投入4%多聚甲醛组织固定液中固定，经过脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色、封片后，光镜下观察组织病理学变化。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 寒冷对小鼠动情周期的影响

小鼠动情周期一般为(4～5)d，包括动情前期(Proestrus)1 d、动情期(Estrus)1 d、动情后期(Metestrus)1 d和动情间期(Diestrus)1～2 d(图1)。HE染色后光镜下观察，细胞清晰可见，周期容易辨别。与对照组小鼠相比，低温组小鼠动情间期显著延长(P<0.01)，其余各期未见显著性差异(表1)。

Fig.1Microphotographs of cellular characteristics for the identification of the estrous stage (HE100)

A: Proestrus; B: Estrus; C: Metestrus; D: Diestrus

2.2 寒冷对小鼠体重和子宫脏器系数的影响

在动物建模过程中，各组小鼠行为活动无异常。在实验期间内两组小鼠在体重上没有显著性差异(P>0.05，图2)。与对照组相比，低温组小鼠子宫脏器系数明显较低(P<0.01，表1)。

Fig.2Effects of cold exposure on body weight gain (n=6)

2.3 寒冷对小鼠血清性激素水平的影响

与对照组相比，低温组小鼠血清FSH明显升高(P<0.01)，低温组小鼠血清Prl明显降低(P< 0.01)。血清E2、LH、P水平尚未见差异(P>0.05，表2)。

2.4 寒冷对小鼠子宫和卵巢组织病理学的影响

对照组小鼠子宫整体结构正常，腔壁结构各层完整清晰，上皮细胞呈单层柱状，排列整齐，全层未见充血水肿，箭头所示为子宫腺管，未见明显炎症细胞浸润(图3A)。低温组小鼠子宫上皮细胞排列紊乱，组织可见子宫腺管极度扩张，如图箭头所示，未见充血水肿，未见明显炎症细胞浸润(图3B)。

对照组小鼠卵巢整体结构正常，卵母细胞形态结构正常，透明带光滑，周边颗粒细胞排列有序，组织未见明显出血坏死，箭头所示为卵泡，组织未见明显炎症细胞浸润(图3C)。低温组小鼠卵巢整体结构正常，卵母细胞形态结构正常，透明带光滑，组织可见卵泡数量明显减少，箭头所示为黄体，组织未见明显炎症细胞浸润(图3D)。

Tab. 1 Effects of cold exposure on estrous cycle and coefficient of uterus n=6)

**P<0.01vscontrol group

Tab. 2 Serum levels of E2, FSH, LH, P and Prl n=6)

E2: Estradiol; FSH: Follicle-stimulating hormone; LH: Luteinizing hormone; P: Progesterone; Prl: Prolactin

**P<0.01vscontrol group

Fig.3Morphological characteristics of uterus and ovary (HE100)

A: Control group uterus; B: Cold group uterus; C: Control group ovary; D: Cold group ovary

3 讨论

寒冷作为一种环境因素可以对机体生殖功能产生影响[8]。本实验从体重、子宫脏器系数、血清激素水平和子宫、卵巢组织病理学等方面进行了研究。有研究显示寒冷可使冷暴露组雌性小鼠体重明显低于对照组[9]，本研究中两组小鼠体重无显著差异。子宫脏器系数能反映寒冷对子宫重量的影响，与对照组小鼠相比，低温组小鼠子宫脏器系数明显较低，结合子宫组织病理学检查结果，冷暴露对子宫实质造成了损伤，以子宫上皮细胞排列紊乱和子宫腺管扩张为主。由此推测寒冷造成小鼠动情周期改变的原因可能与子宫损伤有关。

动情周期可以作为体内激素水平变化或生殖器官如子宫和卵巢变化的指征[10]。动情前期雌激素水平最低，上皮细胞增殖缓慢，脱落细胞为有核上皮细胞；动情期雌激素水平到达高峰，刺激阴道上皮增殖，大量无核角化细胞脱落；动情后期属于过渡期，三种细胞均可见[11,12]；动情间期雌激素水平较低，孕激素水平较高，白细胞数量增多，可保护机体免受微生物感染[13]。实验结果表明，低温组小鼠在冷刺激后呈现明显的动情周期改变，主要表现为间期延长。有研究表明，冷暴露能够改变雌性大鼠的动情周期，冷暴露后的雌性大鼠的动情期和动情间期明显延长[6]，与本次实验研究结果相近。还有研究显示动情周期的不规则性可能与雌性小鼠的卵泡发育异常有直接的关系[14]，本实验病理结果显示卵泡数量明显减少，提示寒冷可能造成卵泡发育异常，进而导致动情周期改变。因为周期变化是动态连续的过程，所以每只小鼠所处周期的具体时间难以精确计算，阴道细胞学检查方法仍具有局限性。

血中雌激素水平的变化是反应周期变化的重要指征。E2由卵巢内卵泡的颗粒细胞分泌，主要生理功能为促使子宫内膜增生和增强子宫平滑肌收缩。FSH是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，主要生理功能为促进卵泡成熟。LH由垂体前叶嗜碱性细胞分泌，它作用于成熟的卵泡，能引起排卵并生成黄体，在有FSH存在下，与其协同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟与排卵[15]。Prl为腺垂体分泌的一种蛋白质激素，其对乳腺的作用主要为促进乳腺发育生长，引起并维持泌乳。P是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素，可保护子宫内膜，与雌激素具有协同作用。这些激素对于维持子宫和卵巢内环境起着重要作用。本次实验低温组小鼠FSH高于对照组，提示寒冷可能使垂体前叶分泌FSH增加，进一步使得动情周期延长。性激素分泌受下丘脑-垂体-性腺轴调控，互相影响且较为复杂。有研究表明冷暴露能够引起雌性大鼠生殖激素受体表达在分子水平上的破坏，动情周期改变可能与子宫损伤有关[6]。

综上所述，寒冷可致小鼠血清激素水平和子宫、卵巢组织发生改变，动情周期延长，进而影响生殖功能，但其机制仍需进一步研究探讨。