高效液相色谱法测定注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠中2-巯基苯并噻唑的残留量

徐家根，顾琦欣，傅辰超

1 南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院 药学部，南京 210008；2 南京优科制药有限公司，南京 210009

注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠[1]用于治疗由头孢噻肟单药耐药、对本复方敏感的产β-内酰胺酶细菌引起的中、重度感染药物。原料药头孢噻肟钠其工艺引入的2-巯基苯并噻唑[2]属于基因毒性杂质[3]，将其作为已知特定杂质进行控制研究。

2-巯基苯并噻唑是一种淡黄色粉末或颗粒，具有令人不愉快的气味；熔点在173.0℃以上；难溶于水和正己烷，易溶于丙酮，可溶于乙醇，且具有紫外吸收。高效液相色谱仪中的紫外检测器检测灵敏度高，对于高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势，所以选择液相色谱法紫外检测器检测注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠中2-巯基苯并噻唑的限度更为准确、灵敏。本方法测定的复方制剂头孢噻肟钠舒巴坦钠，与文献中的头孢噻肟钠相比，成分更加复杂，在文献的色谱条件下检测时，存在干扰，见图1。本方法能够为检测注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠中2-巯基苯并噻唑限度提供有效控制方法[4]。

1 材 料

1.1 仪器

LC20-AT 高效液相色谱仪，含真空脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱；梅特勒分析天平（xs-205）。

1.2 药品与试剂

2-巯基苯并噻唑对照品 （纯度：97%，Sigma-Aldrich）；注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠（2∶1，规格：1.5 g，批号：20190601、20190701、20190702，南京优科制药有限公司）；乙醇为分析纯；实验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 限度确认及各溶液浓度设定依据

2-巯基苯并噻唑在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，它属于2A 类致癌物，被视为潜在基因毒性杂质。在《ICH M7 指导原则》推荐的CPDB 毒性数据库中检索到2-巯基苯并噻唑的半数中毒量（TD50值）为344 mg·kg-1·d-1，其主要由头孢噻肟钠生产工艺引入的基因毒杂质，在计算限度值时需要通过头孢噻肟钠的限度值按比例换算。在日本参比制剂（注射用头孢噻肟钠，单方）说明书中，注射用头孢噻肟钠最大日剂量为12g，日最大剂量比本品中头孢噻肟钠日最大剂量高，为保证安全使用12 g 作为日最大剂量计算限度值，得到在头孢噻肟钠中2-巯基苯并噻唑的限度为28.6 ppm，从药品安全性出发，将限度收紧至25 ppm。本品说明书“用法用量”项下舒巴坦最大日剂量为4 g，可得头孢噻肟最大日剂量为8 g，故等比计算限度应为37.5 ppm。为严格控制并修订限度值为0.0035%，计算公式如下：

AI（mg·d-1）=TD50（mg·kg-1·d-1）/50000×50 kg

限度（ppm）=AI（mg·d-1）/最大日剂量（g·d-1）×103

根据“2.4”项下结果，可知2-巯基苯并噻唑定量限浓度为0.03088 μg·mL-1，为保证检验的重现性与准确度，选取2-巯基苯并噻唑定量限浓度的3～5倍作为对照品溶液的浓度。因此确定对照品溶液浓度为0.15 μg·mL-1，依据限度为0.0035%，为方便称量样品，确定供试品溶液浓度为4.5 mg·mL-1。根据分析天平分度值要求及操作规定，本检验方法设计供试品取样量为45 mg。

2.2 色谱条件

采用高效液相色谱法[4]。色谱柱：Kromasil（100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵（55∶45）；柱温：30 ℃；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.3 溶液配制

对照品储备溶液：取2-巯基苯并噻唑对照品适量，精密称定，加乙醇-水（90∶10）溶解并定量稀释制成每毫升中约含2-巯基苯并噻唑为1.0μg 储备溶液。

对照品溶液：精密量取对照品储备溶液1 mL，置10mL 量瓶中，加入乙醇-水（90∶10）稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：取本品45 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙醇-水（90∶10）至刻度，摇匀。

系统适用性溶液：取本品45 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，再精密量取对照品储备溶液1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加入乙醇-水（90∶10）稀释至刻度，摇匀。

空白溶剂：乙醇-水（90∶10）。

2.4 专属性考察

取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液各适量，按“2.2”项下色谱条件进样测定，通过比较图2 可知，空白溶剂不干扰本品中2-巯基苯并噻唑的测定，在系统适用性溶液中2-巯基苯并噻唑单一出峰，其保留时间为8.140 min，峰纯度为1000。对照品溶液中2-巯基苯并噻唑的保留时间为8.067 min，其理论板数为7502。为此，该方法专属性良好，适合本品中2-巯基苯并噻唑的限度测定。

2.5 检测限及定量限确定

取“2.3”项下对照品储备溶液，分别用乙醇-水（90∶10）逐级稀释后，量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比10∶1 计算定量限，其为0.03088 μg·mL-1；按信噪比3∶1 计算检测限，其为0.01544μg·mL-1。

2.6 线性范围

取“2.3”项下对照品储备溶液适量，用乙醇-水（90∶10）稀释制成每毫升中约含2-巯基苯并噻唑为约1μg 的溶液，精密量取该溶液0.3、0.6、1.0、1.2、1.5、2.0mL，分别置于10mL 量瓶中，用乙醇-水（90∶10）稀释至刻度，摇匀，作为2-巯基苯并噻唑对照品系列溶液。精密量取各系列溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。见表1、表2。

表1 2-巯基苯并噻唑标准曲线制备试验结果

表2 耐用性试验结果

试验结果表明，2-巯基苯并噻唑浓度在0.03088～0.2058 μg·mL-1峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.9995）。

2.7 进样精密度试验

取“2.3”项下对照品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6 次，计算各溶液峰面积的相对标准偏差。结果表明，其进样精密度为1.6%，小于4%，进样精密度良好。

2.8 重复性试验

精密称取本品约45 mg，计6 份，采用拟定的测定方法分析。结果表明，2-巯基苯并噻唑的重复性试验的RSD 为2.1%，方法重复性良好。

2.9 耐用性试验

本试验分别考察了不同柱温、检测波长、流速、流动相中甲醇比例对本品中2-巯基苯并噻唑限度测定的影响。由表2 可知，上述因素在一定范围内变化对本品中2-巯基苯并噻唑的影响不大，2-巯基苯并噻唑峰均能满足本品杂质限度测定的要求。

2.10 回收率试验

取注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠 （批号：20190601）90 mg，共9 份，精密称定，分别置于20 mL量瓶中，根据“2.8”项下结果供试品中2-巯基苯并噻唑的检出量为0.0018%，因此加标回收率溶液需向供试品中加入对照品储备液0.6、1.0、1.4 mL（n=3），用乙醇-水（90∶10）溶解稀释并定容至刻度，摇匀，作为待测溶液，按照“2.2 项下”色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算测得量。2-巯基苯并噻唑平均回收率为99.43%，均在80%～120%，平均RSD 为1.0%。

2.11 供试品测定

取3 批供试品各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠中2-巯基苯并噻唑的限度。结果表明，在3 批供试品中2-巯基苯并噻唑的残留量均小于0.0035%，符合质检要求。见表3。

表3 样品中2-巯基苯并噻唑测定结果

3 讨论

注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠为β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组成的复方制剂，具有抗菌谱广、抗菌活性强、疗效确切、不良反应轻的特点。为保证该品质量，采取有效的技术手段尽可能的减少基因毒性杂质在产品中的残留量。本文建立的检测方法具有选择性好、灵敏度高的优点，与文献报道的方法[5]比更好，本法样品配制简便，不需要萃取，可直接配制进样。