云芝糖肽通过调控p-糖蛋白 提高多柔比星胃癌细胞毒性的作用和机制研究*

桑 花，朱卫忠，郑惠华，汤志远**

1 南通大学，南通大学附属医院 药学部，南通 226001；2 南通大学 药学院，南通 226001；3 江苏安惠生物科技有限公司，南通 226000

真菌云芝的提取物云芝多糖及糖肽对乳腺癌[1]、胃癌[2]、结肠癌[3]、食管癌[4]、肺癌[5]等均有明显抑制和治疗作用。此外，其在肝保护方面也有显著效果[6]，现已开发出如云芝胞内糖肽胶囊、云芝菌胶囊、云芝肝泰胶囊等药物。其抗肿瘤作用机制主要通过抗炎或调节人体免疫功能，提高宿主免疫反应，间接抑制肿瘤发生和生长[7]，临床上常与化疗药物联合应用。而化疗药物在体内的药动学行为受到多种转运体及代谢酶的调控，调节其转运行为的主要有常规药物外排转运体p-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、多药耐药相关蛋白（MRP）等。肿瘤细胞上药物外排转运体表达的改变直接影响了绝大部分化疗药物的药效。有不少报道，中药通过影响药物外排转运体的表达而达到增效减毒的效果。日本学者发现，口服化疗药物及云芝糖肽的胃癌患者比单独服用化疗药物的患者总体生存期高[2]；其机制研究主要围绕免疫增强展开，目前还未有从药物相互作用角度探究云芝糖肽辅助化疗药物增效的机制研究。多柔比星是P-gp 的底物，其在肿瘤细胞内的累积量与外排转运体P-gp 的表达密切相关。因此本研究从药物外排转运体入手，探讨云芝糖肽增加化疗药物多柔比星抗肿瘤药效的机制，以期为临床应用提供参考。

1 材 料

1.1 细胞株

人胃癌肿瘤细胞AGS 细胞株，购自中科院上海细胞库。

1.2 药品和试剂

云芝胞内糖肽胶囊 （江苏苏中药业，批号：19110804）；盐酸多柔比星（中国食品药品检定研究院，纯度98%）；盐酸邻甲苯海拉明（IS，上海阿拉丁生化科技公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；DMEM细胞培养基（美国Gibco 公司）；CCK-8 试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；FITC 偶联p-gp 及同型对照多克隆抗体、TRIzol（美国赛默飞世尔科技）；TB Green Premix Ex TaqTMⅡPCR 试剂、PrimeScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒（日本Takara 公司）；色谱级甲醇（德国默克公司）；色谱级甲酸（美国Dikma 公司）；其他试剂为分析纯；水为超纯水。

1.3 仪器

Imark 型酶标仪 （BIO-RAD）；Nano Drop One微量核酸蛋白浓度测定仪（美国Thermo 公司）；Accuri C6 型流式细胞分析仪（美国BD 公司）；qTOWER 2.0 实时荧光定量PCR 仪 （德国Analytik Jena公司）；液相色谱质谱联用仪API 3200 LC-MS/MS（美国ABSciex 公司）；超纯水仪（德国密理博）。

2 方 法

2.1 云芝糖肽及多柔比星储备液配制

取6 粒（0.5 g/粒）云芝胞内糖肽胶囊的内容物，加30 mL 无菌生理盐水配制成100 mg·mL-1的药液。盐酸多柔比星用纯DMSO 配制成20 mmol·L-1储备液，使用时用培养基稀释到适宜浓度。药品储备液冰箱4 ℃保存。

2.2 通过CCK-8 实验考察云芝糖肽对多柔比星细胞药效的影响

取对数生长期的AGS 细胞，接种于96 孔细胞培养板中，待细胞基本贴壁后，每孔加入含药无血清培养基200 μL。多柔比星组给药浓度如下：0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μmol·L-1；多柔比星+云芝糖肽组在多柔比星组的基础上每孔加入云芝糖肽药液使终浓度为1 mg·mL-1，每个浓度设置6 个平行样本，给药48 h。作用结束后，吸出药液，每孔加入含10 μL CCK-8 试剂的培养基100 μL，置于培养箱继续培养1 h，将细胞培养板于酶标仪450 nm 波长处检测其吸光度值（A），通过SPSS 计算药物IC50值。

抑制率（%）=1-（A给药组-A本底）/（A对照组-A本底）×100%

2.3 LC-MS/MS 测定多柔比星在AGS 细胞内的累积

分别取对数生长期的AGS 细胞，接种于24 孔细胞培养板中，待24 h 细胞基本贴壁后，吸出含血清培养基，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1）的无血清培养基1 mL，作用48 h，每个浓度设置6个平行样本；然后每孔加入多柔比星使其终浓度为10 μmol·L-1，作用时间2 h。作用结束后，冰PBS 液清洗细胞2 遍，每孔加入300 μL 超纯水，置-80 ℃冰箱反复冻融3 次，破碎细胞，取20 μL 细胞悬液以BCA 法测定蛋白浓度，取100 μL 细胞悬液，加入300 μL 含内标（IS，5 μg·L-1邻甲苯海拉明）的甲醇溶液，振荡、离心2 次后，取5 μL 上清液进样。胞内药物累积量用每毫克蛋白质吸收的药物量表示。

色谱条件：色谱柱Luna 3u C18（2）柱，150 mm×2.0 mm，100 A （Phenomenex）；流动相由0.1%甲酸（A）和甲醇（B）组成，梯度洗脱：0～0.5 min（20%B）、0.5～0.8 min（20%～80%B）、0.8～4 min（80%～20%B）、4～8.5 min（20% B）；柱温为40 ℃；进样盘温度为4 ℃；流速为0.2 mL·min-1。

质谱参数：电喷雾离子源（ESI）；正离子检测；离子喷雾电压：4.8 kV；加热毛细管温度：285 ℃；鞘气（N2）流速：735 kPa；辅助气（N2）：1050 kPa；碰撞气（Ar）压力：1.5 kPa；多反应离子检测（MRM）；用于定量分析的离子对分别为m/z 544.2→361.2 （多柔比星）和m/z 270.2→181.2（邻甲苯海拉明）。

2.4 RT-PCR 法测定AGS 细胞P-gp、BCRP、MRP 转运体的mRNA 表达水平

取对数生长期的AGS 细胞，接种于6 孔细胞培养板中，待细胞基本贴壁后，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1）的无血清培养基2.5 mL，作用48 h，每个浓度设置3 个平行样本。①用TRIzol提取细胞总RNA；②参照PrimeScriptTMRT Master Mix 逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA；③按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行PCR 检测得到Ct 值；④采用2-ΔΔCT法（Livak 法）半定量分析RT-PCR 检测结果。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 流式细胞术检测AGS 胃癌细胞表面P-gp 蛋白的表达

取对数生长期的AGS 胃癌细胞，接种于6 孔细胞培养板中，待细胞基本贴壁后，每孔加入含云芝糖肽（0、0.2、0.5、1.0 mg·mL-1） 的无血清培养基2.5 mL，作用48 h，每个浓度设置3 个平行样本。作用完成后，胰酶消化液消化细胞；加入FITC 偶联的抗Pgp 多克隆抗体（1%BSA-PBS 配制，稀释比例为1∶20）或同型对照（未进行免疫小鼠血清纯化的IgG1）100 μL，37 ℃避光孵育2 h，用流式细胞仪检测AGS细胞表面P-gp 的表达。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 云芝糖肽对多柔比星在AGS 胃癌细胞内药效的影响

通过线性回归分析得到云芝糖肽单独作用AGS 细胞72 h 的IC50为3.9 mg·mL-1，选择1.0 mg·mL-1的云芝糖肽作用于AGS 细胞48 h 时，对细胞没有毒性。多柔比星单独作用AGS 细胞48 h 的IC50为0.587 μmol·L-1，当联合1.0 mg·mL-1的云芝糖肽时，IC50显著降低为0.173 μmol·L-1，见图1。云芝糖肽能显著提高多柔比星对AGS 细胞生长的抑制率，提高其药效，与单用多柔比星相比有统计学意义。

3.2 云芝糖肽对多柔比星在AGS 胃癌细胞内累积的影响

经不同浓度云芝糖肽作用48 h 后，LC-MS/MS结果显示在AGS 胃癌细胞内，多柔比星给药2 h 的累积量较对照组显著增加，且随着给药浓度的提高，细胞内累积量增加，中、高浓度有统计学差异（P<0.05），见图2。表明云芝糖肽提高多柔比星的药效是可能通过提高多柔比星在细胞内的浓度达到的。

3.3 云芝糖肽对AGS 胃癌细胞P-gp、BCRP、MRP 的mRNA 表达的影响

经过不同浓度云芝糖肽作用后，荧光定量RTPCR 结果显示，云芝糖肽在中、高浓度能显著抑制P-gp 的基因表达（P<0.05），且随着浓度升高，抑制强度增大，见图3-A。而云芝糖肽对BCRP、MRP 的mRNA 表达没有显著影响（见图3-B，3-C）。结果表明，云芝糖肽能抑制AGS 胃癌细胞P-gp 转运体的mRNA 表达。

3.4 云芝糖肽对AGS 胃癌细胞表面P-gp 蛋白表达的影响

经不同浓度云芝糖肽作用48 h 后，细胞流式结果显示AGS 细胞表面的P-gp 蛋白表达（见图4，彩色）随给药浓度的增加而逐渐降低，表明云芝糖肽能抑制AGS 细胞膜上P-gp 转运体的表达，从而影响细胞内依赖P-gp 转运的药物累积。

4 讨论

云芝糖肽作为免疫增强药，主要用于慢性乙型肝炎和肝癌的辅助治疗以及增强免疫力。云芝糖肽的直接细胞杀伤作用很弱，主要通过影响巨噬细胞或者抑制肿瘤血管生成而间接发挥细胞杀伤作用，还能激活中性白细胞，拮抗化疗药所致细胞免疫抑制，改善细胞免疫功能。

癌症治疗中的药物相互作用一直是临床用药必须考虑的方面，肝药酶抑制剂、诱导剂直接影响了其它药物的代谢，造成药效降低或者毒性增加。化疗药物作为非靶向制剂，如何提高其在肿瘤中的浓度一直是研究的重点，已有研究证明，中药及其相关制剂可以提高药物在肿瘤中的分布，如参麦注射液可以提高多柔比星、紫杉醇、5-FU 在结肠癌细胞及荷瘤鼠肿瘤中的累积，起到增效减毒的作用[8]。其他真菌多糖如灵芝多糖能逆转阿霉素耐药株的多药耐药[9]，而云芝多糖及糖肽还未有相关报道。因此，本研究从药物相互作用入手，以寻找云芝糖肽通过改变药物转运体的表达从而影响化疗药物的药效机制。实验显示，云芝糖肽在体外能显著增加多柔比星对AGS 胃癌细胞的药效，表明其有协同增效的作用。确定云芝糖肽可以提高多柔比星的药效后，从药物代谢角度探究云芝糖肽是否影响多柔比星在肿瘤细胞内的累积，以LC-MS/MS 测定肿瘤细胞内多柔比星的浓度，结果显示，云芝糖肽显著增加胞内多柔比星的累积量。随后，RT-PCR 检测结果显示，云芝糖肽能显著抑制AGS 胃癌细胞的P-gp mRNA 表达，且随着给药浓度增加抑制强度增加。进一步使用流式细胞术对肿瘤细胞表面P-gp 蛋白的表达进行检测，得到与RT-PCR 一致的结果。

综上所述，本研究从体外细胞角度发现，云芝糖肽提高多柔比星在AGS 肿瘤细胞药效的机制可能与抑制P-gp 的表达有关，细胞上药物外排转运体的减少降低了多柔比星的外排，提高了肿瘤细胞内的多柔比星的浓度，增加细胞毒性，达到协同增效的作用。后续实验部分，将采用荷瘤鼠模型研究云芝糖肽的协同抗肿瘤作用。本研究期望为云芝胞内糖肽胶囊在临床上的辅助化疗作用增加新的依据。

致谢

感谢南通市疾病预防控制中心对本研究提供液相色谱质谱联用仪的支持。