慢性胰腺炎患者肠道微生态的变化及其与胰腺内外分泌功能不全的关系

孟雨亭 徐佳佳 周春华 赵九龙 周 玮 蒋 琪 张 尧 邹多武

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一种以胰腺的病理性纤维化为特征的炎性综合征，临床表现为反复上腹痛、胰腺炎急性发作，以及胰腺内外分泌功能不全。胰腺内分泌功能不全主要表现为糖尿病，与1型和2型糖尿病不同，CP继发性糖尿病主要由胰岛细胞损伤引起，属于3C型糖尿病(type 3 diabetes mellitus, T3DM)[1]。胰腺外分泌功能不全(pancreatic exocrine insufficiency,PEI)可导致脂肪和其他营养物质消化不良，PEI程度可通过粪弹力蛋白酶1(fecal elastase 1,FE1)水平来反映。

肠道微生物是宿主代谢的重要组成部分，在机体免疫的平衡和紊乱中起着重要作用[2]。微生态失调与多种胃肠道疾病(炎症性肠病、肠易激综合征)[3-4]，以及肥胖、代谢综合征、糖尿病、胰腺癌等其他疾病的发病机制有关[5-7]。约有36%的CP患者可出现小肠细菌过度生长(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)[8]。近年来，有少数国外研究团队关注到CP患者存在不同程度的肠道微生态失调，并且这种紊乱与炎性反应、胰腺纤维化有关，同时，伴有T3DM的CP患者微生态紊乱情况更加明显[9-10]。此外，2018年的一项大样本研究[11]发现，FE1水平的变化与其他因素(如年龄、性别、BMI等)相比，可以在更大程度上反映肠道微生物的变化。本研究旨在探讨伴有T3DM的CP患者肠道微生态的变化，以及这种变化与T3DM和PEI的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年8月—2018年9月间在上海长海医院消化内科住院治疗的CP患者，其中CP不伴糖尿病者(不伴糖尿病组)30例和CP伴糖尿病者(伴糖尿病组)31例，另选择与患者一起生活至少10年的健康家属60名作为对照组。CP患者诊断标准参照亚太共识[12]，所有受试者的年龄限制为18～60周岁，排除标准：近1个月内使用过抗生素，严重酗酒，患有肠易激综合征、肥胖、肝病等慢性疾病，DNA提取质量不佳。本研究经上海长海医院伦理委员会批准，每位参与者均签署知情同意书。

1.2 样本收集方法 通过上海长海医院住院病历系统收集CP患者的临床资料，检测并记录对照组的BMI和空腹血糖(fast blood glucose,FBG)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)水平。使用无菌容器收集所有受试者的粪便样本后，置于盛满冰块的容器中于2 h内送至实验室，储存于-80℃冰箱用于下一步检测分析。

1.3 肠道微生物测序 肠道菌群的测序流程主要包括脱氧核糖核酸(DNA)提取、靶基因的PCR和高通量测序。按照标准操作流程，使用粪便DNA快速提取试剂盒[安倍医疗器械贸易(上海)有限公司]进行DNA提取。应用PCR扩增系统(GeneAmp 9700, 美国ABI公司)对各样本16S核糖体核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)的V3、V4区域进行扩增，正向、反向引物分别为338F (5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3’)、806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)。使用AxyPrepDNA (美国Axygen公司)凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收纯化，并应用FLx800酶标仪(美国BioTek公司)对回收产物进行荧光定量。将扩增产物等量汇集，应用Illumina MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序。

1.4 高通量测序数据处理 高通量测序的原始数据在分析前需要进行处理和质量控制，本研究的原始数据格式为FASTQ格式。首先采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一作质量筛查。随后应用FLASH软件(http:∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接。最后，根据每个样本所对应的索引信息(即条码序列，为序列起始处用于识别样本的一小段碱基序列)，将连接后的序列识别分配入对应样本(要求索引序列完全匹配)，从而获得每个样本的有效序列。应用UPARSE软件(http:∥drive5.com/uparse/)、相似性阈值设定为97%，对通过质量筛选的序列进行聚类，获得操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)。采用核糖体数据库(ribosomal database project, RDP)分类算法(http:∥rdp.cme.msu.edu/)，对照16S rRNA数据库 (http:∥www.arb-silva.de)，对获得的OTU进行分类，置信度阈值为70%，可以获得各样本门、纲、目、科、属、种水平微生物的丰度表。通过京都基因和基因组全书 (Kyoto enclyopedia of genes and genomes, KEGG)同源性分析[13]，对每个样本的代谢通路进行预测。

1.5 FE1检测 使用FE1检测试剂盒(德国ScheBO®·Biotech AG公司)按照标准操作流程进行。首先使用ScheBO®·Master Quick-PrepTM样品准备系统对粪便样品进行取样和抽提，之后将10 μL提取物加入900 μL缓冲液进行稀释。将标准品、对照品和稀释后的样品各50 μL分别加入96孔板，于室温下孵育30 min，随后每孔加入抗弹力蛋白酶1-生物素-过氧化物酶-链霉亲和素复合物(anti-E1-biotin-peroxide-streptavidin-complex)50 μL在室温黑暗条件下孵育15 min，最后每孔加入100 μL底物进行显色反应。加入100 μL终止溶液终止显色反应后，应用酶标仪进行检测，检测波长405 nm，参考波长492 nm。应用ELISA分析软件进行数据分析和标准曲线构建，最终得到每个样品的FE1质量比(μg/g)。

2 结 果

2.1 一般资料 伴糖尿病组FBG水平显著高于不伴糖尿病组和对照组，而Hb水平显著低于不伴糖尿病组和对照组(P值均<0.01)。见表1。伴糖尿病组的病程显著长于不伴糖尿病组、胰腺萎缩率显著高于不伴糖尿病组、FE1水平显著低于不伴糖尿病组(P值均<0.01)。见表2。

表1 所有受试者的一般资料比较

与伴糖尿病组比较，①P<0.01

表2 伴糖尿病组与不伴糖尿病组患者的临床特点比较

ERCP为内镜下逆行胰胆管造影术，ESWL为体外冲击波碎石术。与伴糖尿病组比较：①P<0.01

2.2 菌群多样性分析 通过对高通量测序原始数据的质控和修剪后，按照样本中最小序列数，将所有样本的序列数随机抽取至统一数据量，平均每个样本有19 139条高质量序列。总OTU为2 791个，其中伴糖尿病组独有的OTU为128个，不伴糖尿病组独有的OTU为71个，对照组独有的OTU为1 200个。通过α多样性分析得到每个样本的α多样性指数，并对指数间的差异进行统计学检验。结果显示，3组间的Shannon、Ace、Chao1、Sobs、PD、Coverage指数的差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表3。通过OTU水平上的Sobs指数构建稀疏曲线，可见随着样本数量增加，所测得OTU数量逐渐趋于稳定，提示本研究测序数据量足够(图1)。进一步分析表3的数据发现，从对照组到不伴糖尿病组再到伴糖尿病组，Sobs和Shannon指数逐渐降低；说明随着疾病持续时间和严重程度增加，肠道微生态的多样性和丰富性逐渐降低。

组别NShannonSimpsonAceChao1SobsPDCoverage对照 603.487±0.7200.097±0.073406.6±235.0399.92±219.98309.15±164.3926.28±14.770.996±0.002不伴糖尿病303.202±0.6630.128±0.099292.0±68.5295.81±71.71232.07±61.0419.53±4.370.997±0.001伴糖尿病313.085±0.5200.117±0.070305.5±136.5302.15±138.23231.10±103.2720.48±8.290.997±0.002

图1 通过Sobs指数构建的稀疏曲线

2.3 群落组成和差异物种分析 通过OTU表比对，进一步在门水平和属水平上对3组样本的菌群结构进行分析。

在群落构成上，3组样本的菌群种类基本一致，均主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门微生物构成(图2)，但各物种丰度有明显差异。从对照组到不伴糖尿病组再到伴糖尿病组，厚壁菌门丰度逐渐下降，变形菌门丰度逐渐上升。见表4。

图2 3组样本主要物种构成比较

3组样本中相对丰度>1%的属共有27个，相对丰度差异有统计学意义的属有6个，包括埃希菌-志贺菌属、小杆菌属、普氏菌_7属、假单胞菌属、普氏菌_9属和真细菌属，其中小杆菌属、普氏菌_7属在伴糖尿病组中显著富集，埃希-志贺菌属、普氏菌_9属在不伴糖尿病组中显著富集，对照组则是假单胞菌属较为富集。见表5。

对这6个3组间丰度差异有统计学意义的菌属进行相关性分析(图3)，结果显示，伴糖尿病组中显著富集的小杆菌属与普氏菌_7属呈显著正相关关系(r=0.323,P=0.000 3)，推测这两种致病菌间可能存在共生关系。埃希-志贺菌属与普氏菌_9属、真细菌属呈显著负相关(r=-0.244,P=0.007;r=-0.266,P=0.003)，普氏菌_9属与假单胞菌属、真细菌属呈显著正相关(r=0.388,P<0.001;r=0.398,P<0.001)，小杆菌属与真细菌属呈显著正相关(r=0.210,P=0.021)，假单胞菌属与真细菌属呈显著正相关(r=0.206,P=0.023)。

与对照组比较：①P<0.05，②P<0.01

表5 3组样本在属水平的物种相对丰度比较 [M(P25, P75)，%]

与对照组比较：①P<0.05

色轴为相关性r值，色块内数值为P值

2.4 重要性物种分析 通过LDA分析发现，普氏菌_7属是伴糖尿病组的重要物种，LDA值为3.8；普氏菌_9属、真细菌属是不伴糖尿病组的重要物种，LDA值分别为4.3和3.7；假单胞菌属则是对照组的重要物种，LDA值为4.1。结合差异物种分析，可以进一步证明各组中显著富集的物种也是在组间差异中起重要作用的物种。

2.5 KEGG通路预测及其与菌群变化的关系 通过KEGG同源分析预测3组受试者代谢通路变化情况，并与组间差异有统计学意义的菌属进行关联分析。发现CP患者有多条代谢通路出现显著变化，其中伴糖尿病组脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成通路和LPS生物合成蛋白通路显著富集。见表6。将LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路相对丰度与小杆菌属和普氏菌_7属相对丰度进行相关性分析，结果显示，小杆菌属与LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路有正相关趋势(r=0.097,P=0.288;r=0.043,P=0.643)，普氏菌_7属丰度与LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路呈显著正相关(r=0.295,P=0.001;r=0.262,P=0.004)。

表6 3组样本部分差异有统计学意义的代谢通路比较 [M(P25, P75)]

与对照组比较：①P<0.01

2.6 肠道菌群变化与宿主临床指标相关性分析 进一步分析61例CP患者临床特征与相对丰度>1%的菌属的相关性，结果显示，普氏菌_7属相对丰度与FE1、BMI水平呈显著负相关(r=-0.425,P=0.001;r=-0.275,P=0.042)，瘤胃球菌属与BMI水平呈显著正相关(r=0.364，P=0.006)，副杆菌属与FE1、FBG水平呈显著正相关(r=0.285,P=0.035;r=-0.494,P<0.001),与Hb水平呈显著负相关(r=0.360,P=0.007)。

对FBG水平与LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路相对丰度进行相关性检验，结果显示，FBG与这两个通路相对丰度有呈正相关的趋势，但无统计学意义(r=0.114,P=0.215;r=0.128,P=0.160)。

3 讨 论

本研究纳入CP患者的健康家属作为对照，可以在最大程度上排除饮食、地理因素和民族起源对肠道微生物组成的影响[14-16]。

首先，本研究发现CP患者，尤其是伴有糖尿病的患者肠道微生态多样性和丰富性显著低于对照组。伴糖尿病组的患者病程显著长于不伴糖尿病组的患者，而BMI、FE1、Hb水平显著低于不伴糖尿病组的患者；因此推断CP病程越长，其肠道微生态紊乱情况越严重，这一结果与Jandhyala等[9]的研究结果类似。

第二，本研究分析了3组样本在门水平和属水平上差异有统计学意义物种，发现变形菌门、小杆菌属和普氏菌_7属在伴有糖尿病患者的肠道菌群中显著富集，推测这3种菌属可作为诊断CP并发糖尿病的辅助手段。变形菌门的细胞外膜存在LPS，由LPS维持的低度炎性反应与代谢紊乱之间的联系已被证实[17]。小杆菌属能够产生乙酸盐和丙酸盐，但不能产生丁酸盐。丁酸盐和丙酸盐属于肠道微生物通过合成糖苷水解酶分解碳水化合物产生的短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)，SCFA信号通过中枢神经系统和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCR)来调节一系列生理过程，包括能量稳态、脂质和碳水化合物代谢和炎性反应信号的抑制[18]。此外，丁酸盐可能具有免疫调节作用[19]，因此小杆菌属可能对宿主有潜在的负面(炎性反应)和正面(通过SCFA)效应，而整体效应可能通过与其他细菌的相互作用来确定[20]。普氏菌属是一种革兰阴性厌氧菌，是3种细菌肠型之一的中心成分[21]。既往研究发现，普氏菌属丰度增加与非糖尿病胰岛素抵抗[22]、病态肥胖[23]和非酒精性脂肪性肝病[24]相关。近年来的研究[25]结果表明，普氏菌属与炎症性疾病的关系有高度异质性，与宿主危险因素和环境的复杂相互作用有关，特定的普氏菌属物种可能表现出不同的特性。本研究中，伴糖尿病组患者普氏菌_7属丰度明显升高。

第三，KEGG代谢通路预测和FE1检测发现，伴糖尿病组患者的LPS合成通路和LPS生物合成蛋白通路显著活跃，这两条代谢通路丰度与普氏菌_7属丰度呈显著正相关；同时伴糖尿病组患者的FE1水平显著低于不伴糖尿病组，且FE1水平与普氏菌_7属丰度呈显著负相关。LPS可通过Toll样受体(Toll like receptor, TLR)和NF-κB诱导胰岛β细胞炎性反应，从而导致β细胞功能障碍[26]。因此，推测普氏菌_7属丰度可作为诊断CP并发胰腺内外分泌功能不全的辅助手段。

综上所述，CP患者伴有显著的肠道微生态失调，其中伴有糖尿病的CP患者菌群失调情况更严重，变形菌门、小杆菌属和普氏菌_7属丰度显著升高可作为辅助诊断CP并发糖尿病的依据，同时普氏菌_7属亦可辅助判断CP患者胰腺外分泌功能状况。菌群失调是CP的原因或仅仅是CP的结果目前尚不清楚，需要进一步设计完善的临床和基础研究来验证本研究结果并阐明其作用机制。