己酮可可碱调节微RNA-122和过氧化物酶体增殖物激活受体α减轻酒精性肝炎大鼠肝损伤

白志金 田晓娟 丁瑞峰

酒精性肝病(ALD)是我国常见的慢性肝病之一[1]。临床上将ALD分为轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝(AFL)、酒精性肝炎(AH)、酒精性肝纤维化(AHF)和酒精性肝硬化。目前，AH的发病机制仍然不完全明确，推测与乙醇引起的脂质代谢紊乱、氧化应激反应、肝细胞炎性反应等相关。微RNA(miRNA)-122定位于人染色体18q21.31[2]，约占成年个体肝脏总miRNA的72%。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)为miRNA-122的靶基因，属于过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)中一员。本研究旨在探讨己酮可可碱(PTX)对AH大鼠肝功能的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲料 7～8周龄清洁级Wistar雄性大鼠30只，体重为(190±20)g，均由内蒙古医科大学动物中心供应，许可证号为SCXK(蒙)2015-0001。高脂饲料以普通饲料、胆固醇、猪油按质量比87∶3∶10混合固定成型后辐照灭菌。

1.2 主要试剂和仪器 石蜡包埋组织切片miRNA-122提取试剂盒、miRNA-122及其互补DNA(cDNA)第一链合成试剂盒、miRNA-122荧光定量检测试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR 引物购自南京博尔迪生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自美国Bio-Rad公司；GAPDH一抗(ab8245)和PPAR-α一抗(ab3484)购自美国Abcam公司；羊抗鼠二抗(ZB-2305)和羊抗兔二抗(ZB-2301)购自北京中杉金桥公司；ECL显影液(sc-2048)购自美国Santa Cruz公司。5804R低温高速离心机、紫外分光光度计为德国Eppendorf公司产品，Trans-Blot SD半干转电转印仪和Powerpac HQ稳压稳流电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，计算机图像分析仪为美国IPP公司产品，实时PCR仪为中国杭州朗基公司产品；凝胶成像仪为中国上海天能公司产品。

1.3 大鼠的分组和处理 将实验大鼠随机分入空白对照组(对照组)、AH模型组(模型组)和PTX组，每组10只。3组大鼠均予普通饲料进行适应性喂养1周，之后模型组和PTX组改用梯度乙醇灌胃辅以高脂饮食造模，方法参照前期实验[3]和文献[4-5]的方法并加以改进，即以高脂饲料饲喂;1～3周予35%乙醇6.0 g/(kg·d)，4～6周予40%乙醇7.0 g/(kg·d)、7～9周予45%乙醇8.0 g/(kg·d)，10～12周予50%乙醇9.0 g/(kg·d)，均于每日上午9:00灌胃。对照组在同时段予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。PTX组从第9周开始于每日15:00加用PTX灌胃，按成人和大鼠体表面积和药效等效剂量计算PTX剂量为9 mg/(kg·d)[6]，持续4周；对照组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。造模时间共12周。造模结束后，各组大鼠禁食12 h，按各组序号依次称重，腹腔内注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，经腹主动脉采血4 mL，按压止血。立即切除两侧肝韧带，完整摘取肝脏后置于无菌盒内称重。计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。

1.4 血液检测 将血液标本放置10～20 min凝固，必要时可置37 ℃恒温箱中促凝，以1 006.2×g离心10 min。应用全自动生化仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、白蛋白水平。

1.5 肝组织病理学检查 取大小为2.0 cm×2.0 cm的大鼠新鲜肝脏右叶组织2块，分别置入液氮和包埋盒中，用40%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片，经H-E染色后置于光学显微镜下观察。

1.6 实时PCR检测大鼠肝组织 miRNA-122的表达 取上述大鼠肝脏石蜡标本切片10片分别装入1.5 mL Eppendorf(EP)管中，应用miRNA提取试剂盒对不同样本内的总RNA进行提取，再分别检测其浓度。应用miRcute增强型miRNA cDNA第一链试剂盒，提取RNA和完成反转录。条件为42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以cDNA为主，参照增强型miRNA荧光实时测定试剂中体系荧光强度。PCR过程：95 ℃总变性15 min，94 ℃重新变性20 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。完毕后，明确扩增曲线、熔解曲线，PCR反应结束后读取Ct值，利用荧光定量检测仪计算 2-ΔΔCt,并分析 miRNA-122 在各个样本中的表达情况。PCR引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

1.7 Western印迹法检测大鼠肝组织PPAR-α蛋白质表达 从液氮中取出大鼠肝组织，加入预冷的PBS洗涤组织，将放射免疫沉淀裂解液(RIPA裂解液)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂按体积比100∶1∶1配制裂解液，每管加入500 μL裂解液，均化后于4 ℃ 15 min裂解。以1 006.2 ×g离心10 min后，取上清液测定蛋白质浓度。倒入缓冲液混匀，沸水煮10 min变性；经10%SDS-PAGE凝胶电泳，偏聚二氟乙烯(PVDF)薄膜电转印。以5%脱脂牛奶常温封闭1 h，加入一抗(PPAR-α抗体效价为1∶1 000)4 ℃孵育过夜；洗膜加入相应来源的HRP二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，充分洗膜后经ECL显影，于X线下压片、曝光；应用IPP软件分析条带。

2 结 果

2.1 一般情况比较 对照组大鼠精神良好，饮食佳，活动可，反应灵敏，毛色光泽，饲养期间体重逐渐增加。模型组和PTX组大鼠精神萎靡，饮食差，嗜睡，反应迟钝，毛色无光泽，有脱毛、掉毛现象,造模期间体重下降明显；在给予药物干预后，PTX组大鼠精神、饮食较前好转，嗜睡程度减轻，脱毛、掉毛现象好转，体重呈上升趋势。

2.2 大鼠体重、肝重和肝指数比较 对照组大鼠体重显著高于模型组和PTX组(P值均<0.01)；PTX组大鼠体重显著高于模型组(P<0.01)。模型组和PTX组大鼠肝重、肝指数均显著高于对照组(P值均<0.01)，PTX组大鼠肝重、肝指数均显著低于模型组(P值均<0.01)。见表2。

组别体重(g)肝重(g)肝指数(%)对照组348.10±8.929.57±0.582.75±0.11模型组296.20±9.13①13.05±1.05①4.40±0.31①PTX组316.10±10.18①②11.31±0.77①②3.59±0.33①②

与对照组比较：①P<0.01。与模型组比较：②P<0.01

2.3 大鼠肝功能指标比较 模型组和PTX组血清ALT、AST、GGT水平均显著高于对照组(P值均<0.05)，白蛋白水平均显著低于对照组(P值均<0.05)；PTX组血清ALT、AST、GGT水平均显著低于模型组(P值均<0.05)，白蛋白水平显著高于模型组 (P<0.05)。见表3。

表3 大鼠肝功能指标比较

与对照组比较：①P<0.05。与模型组比较：②P<0.05

2.4 大鼠肝组织H-E染色结果 对照组大鼠肝组织小叶结构清晰、完整，肝细胞形态规则、排列紧密，肝索从中央静脉起始，呈放射状有序排列。模型组大鼠肝组织肝细胞变性、肿胀，有较多脂肪空泡，可见脂肪变性，有中性粒细胞和淋巴细胞浸润。与模型组比较，PTX组肝细胞的损伤、脂肪变性、炎性细胞浸润均有不同程度减轻。见图1。

A 对照组 B 模型组 C PTX组

2.5 实时PCR法检测大鼠肝组织miRNA-122的表达 模型组和PTX组miRNA-122的相对表达量分别为13.02±3.46和3.45±1.94，均较对照组(1.00±0.00)显著上调(P值分别<0.01、0.05)；PTX组miRNA-122相对表达量较模型组显著下调(P<0.01)。

2.6 Western印迹法检测大鼠肝脏组织中PPAR-α蛋白质的表达 模型组和PTX组大鼠肝组织PPAR-α蛋白质相对表达量分别为0.52±0.11和0.74±0.08，均显著低于对照组的1.14±0.16(P值均<0.01)；PTX组大鼠肝组织PPAR-α蛋白质相对表达量显著高于模型组(P<0.01)。见图2。

1 对照组 2 模型组 3 PTX组

3 讨 论

ALD发展进程中，AH是非常关键的阶段，炎性反应被认为是影响ALD预后的主要因素[7]，所以在AH阶段进行干预治疗具有重要意义。目前，AH治疗并无特效药物，因此研究可能用于治疗AH的药物和了解相关药物的作用靶点亦具有重要意义。

miRNA-122可以反映肝脏组织的病理学改变。Zhang等[8]的研究证实，miRNA-122在酒精性肝损伤时会升高，并且与肝脏的病理学变化一致。miRNA-122的靶基因PPAR-α属于配体依赖性转录因子核受体超家族，介导脂质能量代谢和炎性反应相关基因的表达。有研究[9]结果表明，ob/ob肥胖小鼠肝脏中miRNA-122表达量的下降能够导致其靶基因PPAR-α的蛋白质表达的增加。

PTX有较好的抗炎和抗免疫效果，能够对氧化应激反应起到一定的抑制作用[3-4]。本研究发现，予大鼠高脂饮食和乙醇灌胃后，模型组和PTX组大鼠均出现不同程度易怒、饮食减少、消瘦、精神差等症状，肝重、肝指数，以及血清ALT、AST、GGT水平均高于对照组，白蛋白水平均显著低于对照组；H-E染色结果提示，模型组的肝组织呈现出脂肪变性、气球样变，炎性细胞有高度浸润的现象，说明造模成功。经过药物干预，PTX组大鼠一般情况好转，与模型组比较，体重有所上升，而肝重、肝指数和血清ALT、AST、GGT水平均下降，白蛋白水平上升；肝组织病理学变化也有所好转，脂肪变性和炎性反应均有不同程度减轻。说明PTX具有减缓大鼠AH进展，改善病情的作用。

miRNA-122特异性表达于肝脏，广泛参与肝脏的病理生理过程，对肝脏的生长、发育、代谢，对肝细胞异常增殖、凋亡、调控和参与肝脏疾病的形成，均有一定的作用。Laterza等[10]发现，miRNA-122对肝脏的损伤较ALT、AST等传统标志物的特异度和敏感度更高，且与肝脏组织病理学变化更具相关性，提出miRNA-122可作为独立的肝脏组织损伤的生物学标志物。动物研究[8,11]发现，在酒精性肝损伤时外周血和肝脏miRNA-122有明显上调。本研究发现，AH大鼠肝脏 miRNA-122存在特异性高表达，在PTX干预后miRNA-122表达下调，提示PTX可能通过下调miRNA-122表达来减轻大鼠酒精性肝损伤，从而改善AH的病情。

PPAR-α是miRNA-122的靶基因之一,可以减少氧化应激，抑制炎性反应，从而缓解乙醇对肝脏的损伤,PPAR-α还能通过调节脂肪酸的生成、氧化和储存相关基因的表达来抑制脂肪在肝脏内的蓄积[12]。曹智丽[13]的研究结果表明,PPAR-α在ALD由AFL逐步进展为AH、AHF的过程中均具有重要阻遏作用，随着肝脏受损的加重，PPAR-α蛋白质表达逐渐减少。

本研究结果显示，在AH大鼠模型中miRNA-122的表达水平显著升高，其靶基因PPAR-α表达下降，说明miRNA-122-PPAR-α途径可能参与介导了AH的发生和发展。经过PTX干预，PTX组大鼠的一般情况、体重、肝重、肝指数、肝功能、肝脏病理学改变均较模型组好转，并通过观察miRNA-122和PPAR-α蛋白质的表达水平，发现miRNA-122表达水平下降时，PPAR-α蛋白质表达水平升高。这说明乙醇可能通过抑制PPAR-α蛋白质的表达使肝脏受损，而PTX可能通过上调PPAR-α的表达来抑制AH的进展。

综上所述，PTX对大鼠AH具有一定的治疗作用，其可能的分子机制为PTX通过下调miRNA-122和上调其靶基因PPAR-α,进一步调控PPAR-α下游靶基因的表达对大鼠AH发挥治疗作用。