一种近红外荧光探针的合成、表征及应用

张逢源，刘晓燕，叶为春，张海霞

(1.兰州大学 化学化工学院，甘肃 兰州 730000；2. 宁夏医科大学 基础医学院，宁夏 银川 750004)

利用荧光分析法，荧光探针通过化学专属性反应达到分析检测的目地. 受体分子与目标分析物作用后，荧光光谱的强度、最大发射位置等发生改变，特异识别和测量目标物. 相较于离子色谱法[1-2]和电化学法[3-6]，荧光光谱法具有操作简单、灵敏度高、背景干扰低、可视化和能成像等优点，在体内原位检测上更具优势，成为了目前最活跃的检测方法之一[7-15].

利用一种荧光探针对多种组分进行检测，是一个经济、实用和高效的方法. 首先通过一锅法合成探针5,10,15,20-四对羟苯基卟啉(THPP)，然后利用红外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和高分辨质谱对其结构进行了表征. 采用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪对荧光探针THPP与各种离子的响应进行了光谱性质的研究. 研究结果可以转化为一个代表性综合实验，这些实验操作不仅锻炼了学生有机合成的技术，而且还可以掌握紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪等仪器的使用以及数据处理的方法. 同时，该实验包括了有机化学、分析化学、仪器分析及无机化学等多个学科的知识点及多种重要的操作技术. 在大学开设综合化学实验的目的就是为了让学生将大学阶段所学习的所有化学课程的知识运用到实际的科学研究中，巩固基本实验操作技能，提高分析解决问题的能力，所以将科研成果转化到本科教学中，对教学科研都具有积极地意义.

1 实验部分

1.1 仪器

Bruker Daltonics APEXII 47e FT-ICR型质谱仪(美国)；400 MHz核磁共振仪(日本)；RF-5301pc荧光光谱仪(日本)；TU-1810型紫外可见分光光度计(中国)；溶液pH值利用PHSJ-3F型pH计测定(中国).

1.2 试剂

硝基苯，丙酸，4-羟基苯甲醛，吡咯，石油醚，乙酸乙酯，二甲基亚砜(DMSO)，九水合硝酸铁，九水合硝酸铝，六水合硝酸锌，三水合硝酸铜，一水合硝酸钙，六水合硝酸镁，硝酸钡，硝酸钠，硝酸钾，硝酸银，六水合硝酸镍，四水合硝酸镉，氯化汞，硝酸铅，碳酸钠，错酸钠，高氯酸钠，硫酸钠，亚硫酸钠，硝酸钠，亚硝酸钠，氟化钠，氯化钠，溴化钠，碘化钠，焦磷酸钠(PPi)，磷酸钠(Pi)，碱性磷酸酶(ALP)，所有试剂均为市售分析纯.

2 实验步骤

2.1 THPP的合成与表征

此步骤包括两次实验：(1)第一次实验为合成探针并得到粗产品. 室温下，将12 mL硝基苯与38 mL丙酸混合搅拌30 min，在混合物中加入1.22 g 4-羟基苯甲醛(0.01 mol)和0.67 g吡咯(0.01 mol). 继续搅拌1.5 h后加入10 mL 石油醚终止反应，将反应体系置于-20 ℃冷冻[16].

(2)第二次实验为提纯产品和表征. 将上述冷冻样品过滤，使用石油醚洗涤沉淀. 使用乙酸乙酯作为溶剂进行索氏提取纯化沉淀，得到深蓝色纯品(产率65%). 对样品进行红外光谱、核磁共振和高分辨质谱表征，解析谱图，确认结构.

2.2 光谱检测

此步骤包括两次实验：(1)第三次实验为Cu2+的测定，包括定量和选择性实验[16]. 配制1.0 mmol/L THPP的DMSO储备液. 制备下列离子的10 mmol/L的水溶液. 除Cu2+作为分析物外，其它离子包括Fe3+、Al3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、K+、Ag+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+作为干扰物.

在离心管中依次加入20 μL THPP储备液，20 μL金属离子的水溶液，最终溶剂体系为50 mmol/L HEPES缓冲溶液(pH=7.4)与DMSO，体积比1∶1. 在以后的光谱实验中，仍然使用该溶剂体系. 实验体系为2 mL，摇匀，室温放置30 min，分别用荧光和紫外-可见分光光度计记录光谱信息.

10 μmol/L THPP与不同浓度的Cu2+混合，制作Cu2+工作曲线，建立Cu2+的荧光分析方法.

光谱实验使用的体系、探针和离子浓度同第三次实验.

在配合物THPP-Cu2+的体系(10 μmol/L)中加入0～1 000 μmol/L的PPi，制作工作曲线，建立PPi的荧光分析方法.

ALP的测定：将不同浓度的ALP(0～100 U/mL)分别与500 μmol/L PPi混合, 再将混合溶液加入到THPP-Cu2+中，制作工作曲线，建立ALP的荧光分析方法.

该工作中荧光测试条件为激发波长：λex/em=560/657 nm，狭缝宽度：5/5 nm.

3 结果与讨论

3.1 探针THPP的合成及结构表征

探针THPP合成路线如图1所示[16]. 产物经过不同表征手段，证实结构正确. 通过红外光谱很容易找到苯环和羟基官能团，核磁共振谱证实不同类型的H和C存在. 高分辨质谱证明其分子量.

3.2 探针的光谱性质的研究

3.2.1 Cu2+检测

实验结果表明THPP与不同金属离子的配位能力不同，在相同的条件下，THPP与铜离子作用力最强，形成的配合物可以猝灭探针荧光，利用此现象可以检测铜离子. 同时，紫外吸收光谱实验发现铜离子改变了THPP的吸收光谱，溶液颜色发生变化，由深粉色变为浅黄色，因此铜离子也可以通过颜色变化得到可视检测. 可以要求学生建立荧光和紫外分光光度法，比较两种方法定量的线性范围.

图1 THPP的合成Fig. 1 Synthesis of THPP

利用THPP与Cu2+的配位反应，实现Cu2+的定量分析. 随着Cu2+的加入，体系在657 nm波长处的荧光发射强度逐渐降低，最终完全猝灭. 探针(10 μmol/L)荧光强度的降低率((I0-I)/I0)与Cu2+(1.0～6.0 μmol/L)的浓度呈现了良好的线性关系，可以确定该浓度范围内未知水样品中Cu2+含量.

3.2.2 PPi检测

PPi 是三磷酸腺苷的水解产物，通过参与酶催化反应，起到能量转导及重要的代谢作用[16]. 所以检测PPi有很重要的意义. 在THPP-Cu2+的体系中加入不同的阴离子，只有PPi使体系荧光强度得到恢复，荧光强度显著增强，其他阴离子没有干扰. 在紫外灯(365 nm)照射下，可以观察到体系的红色荧光. 同样吸收光谱发生了明显的变化，在650 nm处出现了新的吸收峰，与THPP的紫外吸收峰重叠，溶液颜色由浅黄色变成深粉色，能证明PPi与Cu2+配位，释放出THPP，荧光重新出现，实现对PPi的可视检测. 所以可以建立荧光和紫外两种分析方法测定PPi.

在THPP-Cu2+体系中加入PPi，随着PPi浓度的增加，657 nm 处的荧光强度逐渐增强. 浓度为500 μmol/L PPi时，达到饱和，荧光强度不再发生改变. 结果发现THPP-Cu2+体系的荧光强度与PPi浓度(5～50 μmol/L)呈现良好的线性关系，可以定量该浓度范围内的PPi.

3.2.3 ALP检测

ALP是一种酶催化剂，可以水解PPi为Pi，由于Pi无法使THPP-Cu2+的荧光强度恢复，随着ALP的加入，THPP-Cu2+-PPi的荧光强度减弱，从而达到检测ALP的目的. THPP-Cu2+-PPi与ALP(0.1-1.0 U/mL)呈现良好线性关系，可以间接测定ALP.

4 结论

科研成果转化成本科综合实验，需要实验符合本科生的实验时间，符合本科生的操作难度，能有效将不同学科的知识点串联起来. 这个研究成果设计的综合实验，满足上述要求. 新型的近红外荧光探针THPP，是进行细胞和活体成像的优选探针，通过该探针的合成，展现给学生学科的发展前沿，锻炼他们合成与纯化、表征的能力. 通过光谱仪器，利用非常简便的方法来灵敏检测Cu2+、PPi及ALP，让学生建立了选择性、线性范围的概念，也让学生了解如何有效利用一个化学结构. 实际上，该探针可以用于细胞成像，测定细胞中相关物质，但是由于细胞培养和细胞成像，超出了本科生的实验范围，故实验仅仅涉及了体外检测部分.

通过本实验的开设，使学生系统学习了从设计、合成、表征到定量检测的全部过程，学会了荧光光谱仪和紫外-可见分光光度计等仪器的使用，并且掌握了物质进行定量分析的方法. 此外，荧光检测中溶液颜色的变化以及荧光的猝灭和产生，激发了学生对于科学研究的极大兴趣. 此综合实验潜移默化的将有机化学、分析化学、仪器分析及无机化学等知识进行融会贯通，对高年级学生的毕业论文设计以及今后继续从事科研工作打下了良好的基础.

上述工作结果在实验室已经验证，具有很好的重复性. 实验结果可以对照张逢源博士论文[16]，验证其正确性. 其中探针测定铜离子的部分内容在兰州大学本科生的基础实验和综合实验中进行了实践，效果良好.

说明：科研成果主要来自兰州大学化学化工学院张逢源博士的学位论文(2019.1).