超高效液相色谱-串联四极杆质谱法筛查青黛中非法掺入的染色物质

许晓辉，杨志敏，朱天虹,张虹艳，李晨曦，杜锐浒

(兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050 )

青黛为爵床科植物马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)或十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort)的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块. 青黛具有凉血、清热解毒的功效，常用于温毒发斑、胸痛咳血、小儿惊痫等，是一种廉价易得的中药材[1]. 《中国药典》一部收载了青黛的质量控制检验方法. 近年来，监督抽检发现，市售青黛质量差异较大，存在掺伪染色现象[2-3]. 而非法掺入的染色物质有毒、致癌，食用染色的青黛不仅无预期疗效，反而会加重病情，对人体带来严重的危害. 为了对青黛的质量进行控制，有必要对青黛染色物质进行全面监测. 常用于青黛的染色物质主要有孔雀石绿、隐色孔雀石绿、天青A、天青B、天青C、亚甲基蓝等，其中，隐色孔雀石绿是孔雀石绿的代谢产物，在非法掺入时，都是以成品形态的化学化合物添加. 目前已报道的孔雀石绿的检测方法主要有高效液相色谱法和拉曼光谱法[4-5]，其他与孔雀石绿相似的染色物质未见文献报道. 液相色谱难以分离复杂基质样品，导致准确地定性定量存在一定困难，而拉曼光谱的基底不容易制备. 液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)作为一种适合于微量复杂基质样品的检测技术，具有灵敏度高、准确性好等优势. 本文采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS )，建立了以多反应监测模式(MRM)定性定量测定青黛中非法掺入染色物质孔雀石绿、隐色孔雀石绿、天青A、天青B、天青C、亚甲基蓝的方法，该方法前处理简单，一针进样，在13 min内可同时测定6种染色物质，能够对青黛非法掺入染色物质的监测提供技术支撑.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-质谱联用仪6460：配有电喷雾离子源(美国安捷伦有限公司)；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g(梅特勒-托利多有限公司)；真空泵(天津市津腾试验设备有限公司)；移液枪：20、100 μL和1.00 mL(德国艾本德)；涡旋混合器(美国Scientific)；离心机(德国艾本德)；超声波清洗器(美国Corning)； 容量瓶(天玻仪器)；超纯水(密理博，纯水净化系统)；乙腈(色谱纯，德国Merk)，甲酸、乙酸铵(色谱纯，东京化成工业株式会社)，青黛样品：购自市场上的青黛粉末.

标准品： 孔雀石绿草酸盐(Lot：107047，纯度：95.8%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；隐色孔雀石绿(Lot：G139783，纯度：99.6%，Dr. Ehrenstorfer GmbH)；孔雀石绿草酸盐-D5(Lot：OP022，纯度：99.6%，WiTEGA)；隐色孔雀石绿-D6(Lot：OP015，纯度：100%，WiTEGA)；亚甲基蓝(Lot：1-DRJ-57-1，纯度：96%，Toronto Research Chemicals)；天青A(Lot：B420BA0016，纯度：80%，BBI Life Sciences)；天青B(Lot：B326BA1467，纯度：75%，BBI Life Sciences)；天青C(Lot：EC19BA0005，纯度：50%，BBI Life Sciences) .

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0×100 mm，2.7 μm)；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：3 μL; 流动相A为含0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸铵的水溶液，B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱程序如表1所列.

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3 质谱条件

电离方式：ESI，正离子模式(+)；监测方式：多反应监测(MRM)；雾化气：N2；干燥气流速：8 L/min；喷嘴电压：500 V；气流温度：325 ℃；毛细管电压：4 000 V；鞘气流速：12 L/min；鞘气温度：350 ℃；定性离子对、定量离子、碎裂电压、碰撞能量和离子化模式如表2所列.

1.4 溶液制备

1.4.1 对照品溶液制备

6种染色物质标准储备溶液：分别精密称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、天青A、天青B、天青C、亚甲基蓝对照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成单个质量浓度均为 1 mg/mL的储备液，置 4 ℃冷藏备用. 使用时用乙腈-水(体积比20∶80)稀释配制成不同浓度的混合中间液和混合标准使用液.

表2 6种染色物质的主要质谱参数Table 2 Major mass spectral parameters of 6 dyes

孔雀石绿草酸盐-D5、隐色孔雀石绿-D6内标储备溶液：分别精密称取孔雀石绿-D5、隐色孔雀石绿-D6对照品10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，配制成单个质量浓度均为 1 mg/mL的储备液，置 4 ℃冷藏备用. 使用时用乙腈-水(体积比20∶80)稀释配制成不同浓度的混合中间液和混合标准使用液.

1.4.2 供试品溶液制备

精密称取样品0.2 g(精确至0.000 1 g)，置于50 mL离心管中，精密加入含5%甲酸的乙腈溶液10 mL，涡旋1 min，超声提取30 min，放冷至室温，5 000 r/min离心10 min，上清液经微孔滤膜过滤(0.22 μm，有机相)，取续滤液作为待测液.

1.4.3 阴性样品溶液的制备

按照“1.4.2供试品溶液制备”步骤，取未检出6 种染色物质的青黛粉末样品同法制成阴性样品溶液，即空白基质样品溶液.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

由于这6种染色物质在乙腈和水中都具有较好的溶解度，另一方面，根据预试验发现,酸度对染色物质的提取有影响. 因此，考察了含1%、3%、5%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂对回收率的影响，结果表明，酸度在1%～5%之间时，提取回收率变化差异不是很大. 考虑到这6种染色物质在酸性溶液中更易溶解，为定量测定提供保障，最终选择含5%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂. 在超声提取时间上，考察了10、20、30 min的提取回收率，随着时间的延长，提取回收率有所提高，但是无显著差异，最终选择超声提取30 min.

2.2 色谱-质谱条件优化

液相色谱分离条件的优化：液相色谱检测极性化合物时，分离常用的色谱柱有C18和C8 两种. 本方法采用适合极性化合物分离的Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，选择流速为0.5 mL/min，使柱压达到适宜的数值，有利于化合物的分离和峰型良好. 流动相的选择和优化：因为供试品溶液的制备使用乙腈，因此设计了乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的水溶液、含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水溶液等4种方案. 通过试验发现，含0.1%甲酸的乙腈-含2 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水溶液优于其它方案，故本方法采用此流动相. 该流动相的优势是加入甲酸提供正离子化环境，加入乙酸铵改善被检测化合物峰型. 质谱条件的优化：用二通阀联接液相色谱与质谱，将6种染色物质储备液稀释至50 ng/mL，分别注入离子源中，在正离子监测模式下对每种染色物质进行一级质谱分析，得到每种染色物质的分子离子峰(Q1扫描). 对每种染色物质的准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息. 选择测定染色物质的定性和定量离子对，然后对所选离子的碎裂电压、碰撞能量进行优化，使检测灵敏度达到最佳. 然后，把质谱与液相色谱连接，确定6种染色物质出峰顺序，进行电喷雾电压、雾化气、离子源温度、辅助气流速等优化，使每种染色物质的分子离子与碎片离子的离子强度达到最佳，据此最终确定为本方法的质谱条件.

2.3 6种染色物质的总离子流图

在 MRM 模式下，测定 6种染色物质的定性和定量离子对色谱图，共 12 个离子监测通道. 其总离子流图如图 1所示. 由图1可见，各个化合物峰形对称，每个检测通道互补无干扰，定量准确可靠，其MRM图如图2所示.

图1 6种染色物质的总离子流图Fig. 1 Total ion flow of 6 dyes

图2 6种染色物质的MRMFig. 2 MRM of 6 dyes(a) 孔雀石绿，(b) 隐色孔雀石绿，(c) 天青A，(d) 天青B, (e) 天青C, (f) 亚甲基蓝, (g) 孔雀石绿-D5,(h)隐色孔雀石绿-D6

续图2

2.4 专属性考察

取阴性样品溶液 3 μL，按“1.2色谱条件”和“1.3质谱条件”进样采集数据，得到6种染色物质阴性样品溶液的MRM色谱图，均未见有其他色谱峰干扰6种染色物质的目标物成分. 结果表明，上述青黛样品基质不干扰目标物的测定，方法专属性良好.

2.5 线性关系、检出限、定量限及回收率

取混合标准使用溶液，利用空白基质样品溶液稀释配制标准曲线溶液，得到质量浓度为0.5、1、2、4、6 、8、10、20、30 ng/mL的标准曲线点，外标法定量，X轴为浓度，Y轴为峰面积响应值，得到各个染色物质的线性回归方程(如表3所列)，用于计算实际样品中待测物的浓度. 结果显示，6 种染色物质在 1～30 ng/mL之间线性关系良好，R2在 0.998 8～0.999 6之间. 取阴性样品，混合标准使用溶液通过最小添加量，按“1.4.2供试品溶液制备”同法处理后上机进样，以信噪比为3计算各个染色物质的检出限(LOD)，以信噪比为10计算各染色物质的定量限(LOQ). 6种染色物质的检出限在0.5～1.0 ng/g之间，定量限在1.0～2.0 ng/g之间，结果如表3所列.

表3 6种染色物质线性关系、检出限、定量限、回收率Table 3 Linear relationships, detection limits, quantitation limits and recovery rates of 6 dyes

2.6 回收率考察

向阴性样品中添加低、中、高三个水平的混合标准中间溶液，按“1.4.2供试品溶液制备”进行处理，上机测试，每个添加水平平行制备3份样，每个样平行测定6次，做加标回收试验，3个水平的回收率在79.7%～119.7%之间，结果如表3所列.

2.7 精密度考察

取质量浓度均为 8 ng/mL 的混合标准使用溶液3 μL，按“1.2色谱条件”和“1.3质谱条件”进样测定，连续测定 6 次，分别计算孔雀石绿、隐色孔雀石绿、天青A、天青B、天青C、亚甲基蓝的精密度，其 RSD%分别为1.8%、1.8%、1.7%、0.7%、1.8%、1.4%，RSD%范围在0.7%～1.8%之间，表明方法的精密度良好.

2.8 样品测定

应用本方法对市场采购的8批青黛样品进行测定，未检出染色物质孔雀石绿、隐色孔雀石绿、天青A、天青B、天青C、亚甲基蓝，青黛样品的总离子流图如图3所示.

图3 青黛样品的总离子流图Fig. 3 Total ion flow of indigo naturalis sample

3 结论

本文以青黛中非法掺入染色物质为研究对象， 通过优化样品前处理条件和色谱质谱条件，建立了青黛中非法掺入染色物质的液相色谱-质谱联用检测方法. 对建立的方法进行了方法学验证，其检测限、定量限、准确性和精密度良好，并使用本方法进行了实际样品测定. 结果表明，本方法前处理简单高效快速、灵敏度高、专属性强，可以用于对青黛中非法掺入染色物质进行快速筛查，为青黛质量控制提供了保障.