清营汤对病毒性心肌炎小鼠炎性因子水平和IGF-1表达的影响

崔利萍，崔艳花2，刘晓东3，周 丽，刘玉洁

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由嗜心肌病毒感染心肌引起的心肌炎症性疾病，以心肌细胞变形及坏死或间质性炎症为主要特征，位于儿科心肌炎的首位，发病率呈逐年上升趋势[1]。肠道柯萨奇病毒B(CVB)是引起病毒性心肌炎的主要病原，流行病学研究显示，病毒性心肌炎病人常有近期CVB 感染[2]。病毒性心肌炎尚无有效且系统的治疗方法，逐步引起了医务人员的重视。经典方剂清营汤具有清营解毒、滋阴透热之功效，现代常用于乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、脓毒症等急性感染性疾病[3]。本研究通过柯萨奇病毒B3(CVB3)感染小鼠建立病毒性心肌炎模型，探讨清营汤对病毒性心肌炎小鼠死亡率、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及心肌组织中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF-1受体(IGF-1R)表达的影响，为临床防治病毒性心肌炎提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只近交系BALB/c 雄性小鼠，4周龄，体重16～18 g，购于河南省实验动物中心。

1.2 实验药物 清营汤：水牛角30 g，生地黄15 g，玄参9 g，竹叶3 g，麦冬9 g，丹参6 g，黄连5 g，金银花9 g，连翘6 g。按方剂比例称取药材适量，加10倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，调整浓度为相当于生药1.05 g/mL。

1.3 主要试剂与仪器 CVB3病毒液由郑州大学微生物与免疫学教研室惠赠，病毒液组织培养半数感染量为100 TCID50/0.1 mL；CK-MB、AST、LDH、IL-6、IL-10、TNF-α 酶联免疫吸附实验(ELISA)测定试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；IGF-1、IGF-1R单克隆抗体购自Santa Cruz公司；ELX-800型酶标仪(美国BIO-TEK公司)；T10型高速组织匀浆机(德国IKA公司)；RM2245型病理切片机(德国Leica公司)；CX31型显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制备与分组给药 60只BALB/c小鼠按体重随机分为正常对照组、模型组和治疗组，每组20只。模型组和治疗组小鼠每只按0.1 mL腹腔注射CVB3 病毒100 TCID50/0.1 mL的CVB3病毒液0.1 mL，连续注射3 d建立小鼠病毒性心肌炎模型[4]。正常对照组腹腔注射等体积生理盐水。首次注射病毒液2 h后开始灌胃给药，治疗组灌胃清营汤21.0 g/kg，正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，连续14 d。

1.4.2 小鼠一般状况和死亡率 实验期间每天观察小鼠的一般情况，记录小鼠死亡情况，计算各组死亡率。

1.4.3 血清心肌酶和炎症因子检测 末次给药后小鼠禁食禁水12 h后称重，眼动脉丛取血，4 000 r/min离心5 min，取上清，按照试剂盒说明书采用ELISA法分析血清中CK-MB、AST、LDH的活性和IL-6、IL-10、TNF-α的含量。

1.4.4 心肌组织病理学变化 小鼠取血后分离心脏，取心脏用4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，常规切片，HE染色，显微镜下观察心肌病理学改变。

1.4.5 Western Blot检测心肌组织中IGF-1、IGF-1R蛋白表达 取100 mg心肌组织提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取适量蛋白样品变性，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，奶粉封闭后漂洗，加IGF-1(1∶500)一抗或IGF-1R(1∶800)一抗孵育过夜，漂洗后以滴加二抗室温孵育2 h，漂洗后在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析，以目的蛋白的灰度值与内参β-actin的灰度值的比值作为蛋白的表达量。

2 结 果

2.1 3组小鼠一般状况、死亡率和心脏指数比较 正常对照组小鼠实验期间进食、活动等正常，毛色光泽，反应灵敏，体重正常，实验期间小鼠未见死亡；模型组小鼠摄食量和活动减少，耸毛蜷缩，毛发无光泽，对刺激反应迟钝，消瘦，实验期间死亡8只(死亡率40%)；治疗组小鼠一般情况较模型组明显改善，实验期间死亡3只(死亡率15%)。3组小鼠死亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 3组小鼠心肌酶水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组小鼠血清CK-MB、AST和LDH水平比较(±s) U/L

1) 与正常对照组比较，P<0.05；2) 与模型组比较，P<0.05

2.3 3组小鼠血清炎症因子水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠血清IL-6和TNF-α水平升高，IL-10含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组小鼠血清IL-6和TNF-α水平下降，IL-10含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 3组小鼠血清IL-6、IL-10和TNF-α水平比较(±s) ng/L

1) 与正常对照组比较，P<0.05；2) 与模型组比较，P<0.05

2.4 3组小鼠心肌病理改变比较 正常对照组小鼠心肌未见病理改变；模型组小鼠心肌组织心肌纤维排列紊乱，心肌间质水肿，可见大量炎症细胞浸润，并伴有多灶性坏死；治疗组小鼠病理病变程度相对模型组有所改善。详见图1。

图1 3组小鼠心肌病理组织学情况(HE染色，×200)

2.5 3组小鼠心肌组织中IGF-1、IGF-1R蛋白表达比较 Western blot结果显示，与正常对照组比较，模型组心肌组织IGF-1、IGF-1R蛋白表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，治疗组心肌组织中IGF-1、IGF-1R表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

与正常组比较，※ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05图2 3组小鼠心肌组织中IGF-1、IGF-1R蛋白表达水平比较

3 讨 论

病毒性心肌炎是由病毒感染心肌所致的心肌及其间质局限或弥漫性炎症，是临床常见的心血管系统疾病，在儿童和青少年中的发病率有逐年上升趋势。病毒性心肌炎具有较高的危害性，部分病人病情迁延，可遗留顽固性心律失常、慢性心功能不全及扩张性心肌病。目前已发现引起该病的病毒有30 余种，其中最主要的是CVB[5]。BALB/c小鼠心肌细胞表面有特异性CVB受体，感染嗜心性CVB3 后导致心肌炎[6]。本研究采用3次腹腔注射CVB诱导病毒性心肌炎模型，病毒感染后小鼠死亡率为40%，心肌病理组织发生明显改变，血清中心肌酶水平显著升高，提示小鼠患病毒性心肌炎，与相关报道一致。

病毒性心肌炎的临床治疗以抗病毒药物、维生素及对症治疗为主，其目的是保护心肌细胞，抑制异常免疫，改善心肌代谢，减少心肌细胞凋亡，从而改善心功能[7-8]。西药的抗病毒效果并不稳定，大量研究表明中药对病毒性心肌炎有良好的治疗作用。清营汤具有清营解毒、滋阴透热之功效，用于温病营分证的治疗，现代常用于急性感染性疾病，如乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、脓毒症等。本研究结果显示，清营汤可降低病毒性心肌炎小鼠的死亡率，改善心肌组织病理学改变，降低血清中心肌酶水平，调节炎症因子的平衡，发挥心肌保护作用。

CK-MB通常存在于动物的心脏、肌肉等组织的细胞质和线粒体中，健康人血清中CK-MB含量较低[9]，当心肌细胞受损，膜的完整性被破坏，CK-MB通过受损的细胞膜进入血液，分析其在血清中的浓度可以提高对心肌损伤诊断的灵敏度和特异性[10]。AST和LDH作为典型的细胞内酶，也存在于心肌细胞内，在心肌细胞发生坏死后释放入血[11]。本研究发现病毒性心肌炎小鼠血清中CK-MB、AST、LDH活性明显高于正常小鼠，清营汤可降低病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶水平。

病毒感染所诱发的免疫反应与心肌损伤密切相关。人体内Th 细胞分为Th1、Th2 两类亚群，生理情况下二者保持动态平衡，维持机体免疫功能的正常发挥。当机体接触抗原后Th1 细胞分泌白介素-2(IL-2)、IL-6、TNF-α、干扰素-γ(IFN-γ)等炎症因子诱导细胞免疫，介导细胞免疫应答，Th2细胞分泌白介素-4(IL-4)、IL-10等促进抗体的产生，介导体液免疫反应[12]。病人在病毒性心肌炎早期，Th1细胞在体内数量较多，主要参与心肌炎症所致的损伤，Th2细胞在恢复期数量逐渐增多，因此，Th2细胞有助于缓解心肌炎，Th1应答则和心肌炎发病密切相关[13-14]。本研究显示，病毒性心肌炎小鼠血清中IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平降低，清营汤干预后心肌炎小鼠血清中IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，表明清营汤可能通过调节机体的免疫平衡状态对病毒性心肌炎产生保护作用。

IGF-1是一类在结构和功能上均与胰岛素相似的生长因子，心肌组织IGF-1来自血液循环和心肌自分泌。大量研究表明，IGF-1在其结合蛋白的调节下与其受体IGF-1R结合，进而保护心肌细胞免于凋亡或抑制心肌细胞凋亡，对心肌组织中存在的多能心肌干细胞有动员并促进其增殖、分化作用，可补充、修复衰老或在病理状态下死亡的心肌细胞[15]。出生后早期IGF-1促进心脏发育，随后其分泌逐渐减少，正常成年心肌组织处于低水平表达。正常机体内环境处于平衡状态，但心肌感染病毒后可出现不同程度的炎性病变，细胞坏死，心肌功能受损，血液及心肌组织中IGF-1和IGF-1R等相关蛋白表达增加[16]，IGF-1有可能通过其抗凋亡、促细胞增殖和干细胞动员作用减少心肌受损。本研究表明，病毒性心肌炎小鼠心肌中血清IGF-1 和IGF-1R表达增加，清营汤干预后小鼠心肌中血清IGF-1和IGF-1R表达减少。

综上所述，本研究证实了清营汤对病毒性心肌炎的保护作用，其作用机制可能与通过调节机体的免疫平衡状态和心肌组织中IGF-1和IGF-1R的表达来实现的，但由于IGF-1对心肌细胞的影响复杂，清营汤保护病毒性心肌炎的具体机制有待进一步深入研究。