双硫仑对甲醛诱导小鼠肝组织生物光子辐射的干预作用

戴甲培，彭梦妮，罗小敏，韩争荣

(1中南民族大学 武汉神经科学与神经工程研究所，武汉 430074, 2中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)

甲醛是一种被广泛应用的重要化工原料，长期接触会对人体器官造成严重损伤，可引起生殖毒性[1]、神经毒性[2]、免疫毒性[3]、遗传毒性[4]等多种生理毒性.甲醛作为国际癌症机构认证的一级致癌物，对肝脏组织有严重的损伤作用，可导致肝细胞核固缩，粗面内质网不规则改变，长时间或者大剂量暴露于甲醛中会引发肝中毒性病变，表现为肝细胞损伤和肝辐射能异常，严重时能引发癌症[5].

双硫仑(DSF, disulfiram)是秋兰姆的一种衍生物，在过去的60年中主要被用来治疗酒精中毒[6]，然而多个实验室研究发现双硫仑除了戒酒作用之外可能还有抗癌效果[7-9].《Nature》杂志报道的一项研究发现，服用双硫仑的癌症患者死亡率比停止服用的患者死亡率降低了34%，说明了其潜在的抗癌作用[10].目前双硫仑的抗癌活性已在体内和体外模型中得到证实，并已在各种癌症类型的人体试验中进行了测试，但其具体的抗癌机制尚不清楚[11].

生物光子又称为生物超弱发光，与有机体的生理、病理状态密切相关[12].生物光子强度改变可能与肿瘤发生有关，肿瘤组织生物光子辐射的峰值明显不同于正常组织，且具有波长特异性[13,14].鉴于双硫仑可能的抗癌作用以及生物光子辐射与癌症组织之间的密切联系，甲醛又是公认的致癌物质，假设双硫仑可能通过影响和调节机体生物光子辐射的变化来参与其抗癌的药理机制.因此，本实验使用超弱生物光子成像系统(ultraweak biophoton imaging system, UBIS)探究双硫仑对甲醛诱导的小鼠肝组织生物光子辐射的干预作用及可能的调控机制.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、D-葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司);双硫仑(Sigma).EM-CCD(iXon Ultra-9100型，日本滨松)；双控恒温灌流槽控制器(中子康医药科技)；低温冷却液循环泵(DLSB-5L/20，巩义市子华仪器)；蠕动泵(BT100-1J，保定格兰恒流泵).

1.2 小鼠肝组织预处理

6～8周龄成年雄性昆明小鼠，购自湖北省疾病预防控制中心,体重为15～20 g，饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食饮水，温度18～25 ℃，湿度40%～60%，在中南民族大学实验动物中心适应1周后进行实验，且经过中南民族大学动物实验伦理委员会批准.实验动物断颈处死取肝组织，迅速放入提前备好的冰浴Krebs Ringer bicarbonate缓冲液(118 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L CaCl2,1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3，11.1 mmol/L 葡萄糖，pH 7.4～7.6)中并除去组织表面的血液，将组织置于震动切片机上设定厚度为700 μm进行切片，选取较为完整的肝组织放入提前1 h通入95% O2和5% CO2混合气的Krebs液中室温复苏40 min.

1.3 生物光子成像与药物处理

将复苏好的肝组织切片放入灌流槽中，100 mL Krebs液灌流.拍摄定位照并保存，定位照采用普通模式(NORMAL-CCD),曝光时间1 s，SPEED 2(FAST).使用温控系统将灌流槽温度以1 ℃/min的速度逐渐升至37 ℃稳定.关闭暗箱门，成像系统改为电子倍增模式进行数据采集，曝光时间60 s，SPEED 1(HIGH)，蠕动泵进水管转速3 r/min,出水管转速9 r/min.成像时间为240 min，30 min延迟发光结束后分别用不同浓度的甲醛Krebs液灌流，在甲醛作用维持期加入双硫仑.实验结束后使用图像处理软件(HCImage)对图像和数据进行处理分析.

采用双尾配对t检验(Paired Two-tailedt-test)进行统计学分析，显著性差异标记如下：*P<0.05(显著性差异)，**P<0.01(非常显著性差异)，***P<0.001(极显著性差异).

2 结果与分析

2.1 甲醛作用下肝脏组织生物光子辐射强度呈浓度依赖性增加

图1a为不同浓度(5, 50, 500 mmol/L)甲醛诱导小鼠肝组织生物光子活动曲线图(n= 6)，图1b为图1a中数据每15个取平均值得到的折线图，其中统计学差异为30 min后每一个点的相对灰度值与加药点的相对灰度值对比所得.结果显示甲醛能明显诱导肝组织生物光子活动的增加，肝组织切片在30 min时加入5 mmol/L甲醛处理可见生物光子活动缓慢增强.90 min时甲醛浓度增加至50 mmol/L后辐射强度快速增加，作用30 min后光子辐射曲线趋于平缓，维持该浓度灌流1 h，光子辐射相对灰度值较30 min初始加药点相比均存在极显著差异(P<0.001, 图1b).150 min甲醛浓度继续增加至500 mmol/L肝组织生物光子辐射上升趋势持续增强，维持该浓度灌流1 h，光子辐射相对灰度值较30 min初始加药点相比也存在极显著差异(P<0.001, 图1b).可见肝组织生物光子辐射的改变随甲醛浓度递增有浓度依赖性差异，选择50 mmol/L甲醛为肝组织灌流最适浓度观察其长时间作用特征改变.

a) 甲醛诱导肝组织生物光子活动特征曲线；b)甲醛诱导肝组织每15 min平均值的生物光子特征曲线图1 甲醛作用下肝组织生物光子辐射强度呈浓度依赖性变化曲线图Fig.1 Concentration-dependent changes of biophotonic emissions in liver tissue under formaldehyde

图2a为50 mmol/L甲醛单独诱导小鼠肝组织生物光子活动曲线图(n= 6)，图2b为2a中数据每15个取平均值得到的折线图，图中统计学差异为30 min后每一个点的相对灰度值与加药点的相对灰度值对比所得.实验结果显示对于50 mmol/L甲醛诱导的肝组织生物光子变化存在着特征性的改变，即启动期—上升期—维持期.50 mmol/L甲醛作用1 h后进入维持期，生物光子辐射强度接近峰值且逐步保持稳定，灌流15 min时相对灰度值与30 min初始加药点相比存在显著性差异(P<0.05)，维持该浓度灌流3 h，光子辐射相对灰度值较加药点相比均存在极显著差异(P<0.001, 图2b)，有利于进一步研究双硫仑对甲醛引起的小鼠肝组织切片生物光子活动的影响.

2.2 双硫仑对甲醛处理的肝组织生物光子辐射有明显抑制作用

图3a为不同浓度(1,5,25 μmol/L)双硫仑调控50 mmol/L甲醛诱导小鼠肝组织生物光子活动曲线图(n= 6),图3b为a中数据每10个取平均值得到的折线图，图中统计学差异为90 min后每一个点的相对灰度值与加药点的相对灰度值对比所得.图4a为小鼠肝组织切片定位照，4b、4c和4d分别对应图3 a中三个时期0～30 min、60～90 min和180～210 min每30 min灰度均值叠加图像.50 mmol/L甲醛诱导肝组织的生物光子活动在1 h后进入灰度值接近峰值的稳定维持期，成像图轮廓逐渐清晰(图4b，4c).在50 mmol/L甲醛诱导的生物光子曲线维持期加入1 μmol/L双硫仑，肝脏组织光子辐射强度有缓慢下降趋势.130 min时药物浓度增加至5 μmol/L，光子辐射强度持续下降，灌流20 min时相对灰度值与初始加药点相比存在统计学差异(P<0.05)，灌流30 min后相对灰度值与初始加药点相比存在非常显著性差异(P<0.01，图3b).170 min时药物浓度继续增加至25 μmol/L，光子辐射强度持续下降，清晰的图像轮廓逐渐变暗(图4c,4d)，在该浓度药物灌流的20 min后生物光子辐射强度与90 min起始加药点相比出现极显著差异(P< 0.001，图3b).

a) 双硫仑对甲醛诱导肝组织生物光子活动干预作用特征曲线；b)双硫仑对甲醛诱导肝组织干预作用每10 min平均值的生物光子特征曲线图3 双硫仑对甲醛诱导肝组织生物光子活动的干预作用曲线图Fig.3 Intervention curve of DSF on formaldehyde-induced biophotonic activity in liver tissue

a)小鼠肝组织切片定位照；b～d) 0～30 min，60～90 min，180～210 min灰度均值叠加图像图4 双硫仑对甲醛诱导肝组织生物光子活动的干预作用代表成像图Fig.4 Representative imaging of intervention of DSF on formaldehyde-induced biophotonic activity in liver tissue

3 讨论

随着甲醛剂量的增加，它对细胞活性的抑制作用也逐渐增强，存在明显的剂量效应关系，这与本实验中甲醛能显著增强小鼠离体肝组织生物光子辐射且存在浓度依赖性差异相一致[15].甲醛能对小鼠的肝脏造成严重的氧化性损伤，如小鼠体内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)明显上升，说明肝细胞、细胞膜均存在一定程度的受损，糖代谢也受到影响[16].肝组织生物光子活动的增加是由于长时间暴露于高浓度甲醛中产生的毒性作用，细胞损伤后释放能量，而生物光子辐射可能作为能量释放的一种方式，通过UBIS系统直观的检测到这种变化.本课题之前的研究发现神经递质谷氨酸导致脑片生物光子的辐射可能与其分子上的活性氢原子的量子能量的改变有关，但细胞内稳态环境的改变如何影响光子活动的变化甚至最终导致疾病的具体生物学机制还有待研究[17,18].

双硫仑能明显抑制甲醛增强的生物光子辐射且存在浓度依赖性差异，25 μmol/L双硫仑对50 mmol/L甲醛处理的肝组织生物光子活动有负调控作用，这可能与双硫仑缓解和修复甲醛导致肝脏损伤，干预生物光子能量传递过程有关.假设双硫仑能通过调节机体生物光子活动发挥药理作用，结果发现甲醛能明显增强小鼠离体肝脏组织生物光子辐射强度且具有浓度依赖性差异，而双硫仑对甲醛诱导的生物光子辐射活动有抑制作用.甲醛虽然是致癌物质，短时间灌流并不足以引起组织癌变，但是通过UBIS系统可以清晰的捕捉到肝组织生物光子辐射的增强.双硫仑作为一种新兴发展的有巨大前景的抗癌药物可能是通过其修复作用降低相应的生化反应，抑制甲醛诱导的肝组织生物光子辐射从而缓解肝脏损伤，但其确切的作用机制还有待进一步研究.

双硫仑作为一种老药新用，具备快速发展成癌症治疗药物的潜力，其药代动力学也已经确立并保证了安全性[19,20].本文发现双硫仑对甲醛刺激下肝组织光子活动的干预作用，同时通过生物光子辐射能量传递的角度解释了双硫仑可能的抗癌机制，在不同的癌症动物或细胞模型中应用并结合生物光子的辐射作为评估指标对于食品安全和环境污染检测以及临床用药的筛选都具有一定的应用价值.