胡荣飞,陈璐瑶,张小妮,吴均坚,何文锦,陈由强,薛婷
福建师范大学a.生命科学学院海洋生物医药与制品产业化开发技术公共服务平台;b.南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心;福建福州350117
随着基因编辑工具的发展,尤其是近年来CRISPR/Cas9 技术[1-2]的开发利用,传统的DNA 提取方法已经无法满足高通量的目的基因筛选工作。尤其对于细胞壁较厚的真核生物和一些非常规物种来说,提取DNA 需要进行大量摸索,不仅耗费试剂,更消耗了宝贵的时间。DNA 的提取无非是破除细胞壁使DNA 释放出来,与传统沸水浴、碱裂解、酶解法、反复冻融、液氮研磨不同的是,在本研究中,我们意图更快速有效地破碎细胞壁来释放DNA,因此采用研磨仪研磨的机械方法破碎细胞壁,使其中的DNA 释放出来,以便用于目的基因快速扩增和基因组DNA 测序。研磨仪研磨法影响细胞破碎程度的因素主要有2 个,即研磨频率和研磨时间。我们探究了研磨频率和研磨时间的不同组合对DNA 提取效果的影响,建立了更好的DNA 提取方法。同时,用茂源链霉菌[3-5]、三角褐指藻[6-7]、酿酒酵母[8-9]验证了该方法在不同物种中的可行性,以期建立一种全物种通用的快速提取基因组DNA 用于PCR 的方法。
茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)11019、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y1H(Leu2-)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)CCAP 1055/1 均为本实验室保存;Biowest Regular Agarose G-10 购自上海生工公司;1.1× T3 Super PCR Mix 购自擎科生物技术有限公司;裂解缓冲液(1 mmol/L EDTA 2 mL,50 mmol/L 磷酸缓冲液250 mL,5% 甘油50 mL,加ddH2O 定容到1 L);1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)。
研磨仪(上海净信实业发展有限公司);5424R 4℃离心机(Eppendorf 公司);PCR 仪、梯度PCR 仪(Applied Biosystems 公司);DYY-6C 电泳仪(北京六一仪器厂);ChemiDOCTMMP 凝胶成像仪(Bio-Rad 公司)。
引物见表1。反应条件:98℃2 min 预变性;98℃ 10 s 变性,Tm 60~65℃ 10 s 退火,72℃ 5~15 s/kb 延伸,32 个循环;72℃延伸2 min。扩增产物采用0.9%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
取适量样品于2 mL EP 管中,加入2 颗灭菌的4 mm 钢珠、100 μL 裂解缓冲液,放入研磨仪中研磨,研磨结束后将样品放入70℃烘箱或水浴5 min,加入20 μL 1 mol/L 的Tris-HCl,上下颠倒几次使混匀,13 000 r/min 离心3 min,取上清液直接作为模板用于PCR。若对PCR 的模板要求较高,也可用酚氯仿抽提后再进行PCR 实验。
在超净工作台中取适量样品放入液氮中冷冻,同时将液氮研磨管和研磨球一同放入液氮中快速冷冻,药匙和2 mL EP 管也一同放入液氮中预冷备用。带上防冻手套,用镊子将样品和研磨球放入液氮研磨管中旋紧,放入研磨仪中研磨。研磨结束后,用液氮预冷的药匙取适量样品粉末于2 mL EP 管中,加入400 μL 裂解缓冲液,于70℃烘箱或水浴5~10 min。加入80 μL 1 mol/L的Tris-HCl,上下颠倒几次使其混匀。加入300 μL DNA 提取液(酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1),涡旋2 次,13 000 r/min 离心5 min。将上层水相吸到1.5 mL EP 管中,不要吸到下层有机相,大约吸300 μL 左右的水相。加入2~2.5 倍体积的无水乙醇或95%乙醇(预先在-20℃预冷沉淀效果更好),-20℃沉淀30 min。4℃,13 000 r/min 离心5 min 沉淀DNA,弃上清,沉淀即为DNA。用75%乙醇(-20℃预冷)清洗离心后的DNA,无需将DNA 混起,上下颠倒几次,仅清洗表面即可。4℃下13 000 r/min 离心1~2 min,弃上清后在超净工作台中吹干或室温挥发残留的乙醇,用100 μL ddH2O 溶解。
表1 PCR扩增引物序列
DNA 提取效果受研磨频率和时间的影响。为确定快速提取DNA 的最优条件,设计了不同的研磨频率和研磨时间组合,见表2。
表2 不同研磨时间和频率的组合
用研磨仪破碎细胞时,如果频率过低,研磨力度不够,导致细胞无法破碎,DNA 无法释放出来;而频率过高,则研磨力度过大,会将DNA 打碎,同时还会缩短研磨仪使用寿命。研磨时间过短,研磨不够充分,DNA 也无法释放出来;研磨时间过久也会打碎DNA,还会缩短研磨仪使用寿命。从实验结果可以看出(图1),当研磨频率为40、50 Hz 时,研磨时间从2 min 增加到5 min 时,提取出来的DNA 在0.9%的琼脂糖凝胶上无法看到任何条带,这是由于研磨频率太低,无法破碎细胞,导致DNA 无法释放或释放量极少。将这8个不同条件提取的无法看到条带的DNA 进行PCR,却发现可以得到SSTI 基因扩增条带,说明该方法即使在很低的研磨频率下,提取到的少量DNA 依然可以用于PCR 实验。当研磨频率达到60、70 Hz 时,研磨时间无论是2、3、4 还是5 min,提取出来的DNA 在0.9%的琼脂糖凝胶上均可看到弥散的拖尾条带,在相同研磨频率下,随着研磨时间的增加,DNA 条带越亮;在相同的研磨时间下,随着研磨频率的增大,DNA 条带也越亮。同样利用这8 个条件下提取的DNA 进行PCR 扩增实验,亦都能获得SSTI 基因扩增条带。
由此证明利用研磨仪破碎细胞提取DNA 用于PCR 完全可行,为了降低仪器的损耗和提高PCR 效果,后续实验中选取的研磨频率为60 Hz,研磨时间为2 min。
图1 不同研磨频率和时间下提取的DNA 电泳图和PCR 电泳图
为了满足基因组测序以及重测序的要求,提取的基因组必须片段完整、纯度高。因此,本实验利用研磨仪结合液氮研磨法来提取茂源链霉菌的完整基因组DNA。机械研磨省去了手工研磨的费时费力,且研磨更加充分,液氮冷冻过的样品很容易磨碎,因而实验中只选取研磨频率作为变量,选取的频率为40、50、60、70 Hz,研磨时间固定为2 min。从实验结果(图2)可以看出,当研磨频率为40 Hz 时就足以磨碎细胞壁,释放出DNA,随着研磨频率的增大反而会打碎DNA,出现拖尾弥散甚至较小的DNA 条带。为了提高DNA 的提取质量,降低仪器损耗,综合考虑,用研磨仪液氮研磨样品提取全基因组DNA 时,采用的频率为40 Hz,研磨时间为2 min。
2.3.1 在茂源链霉菌中的验证 在用研磨仪快速破碎茂源链霉菌细胞后,我们选取了2 个基因片段(447 bp 的SSTI 基因和941 bp 的SSTI 基因加上游片段)对粗提的基因组进行PCR 实验,以验证该方法在霉菌中的可行性,结果选取的2 段目的基因均能从快速提取的茂源链霉菌基因组中扩增出来(图3)。
图2 茂源链霉菌全基因组DNA 提取的电泳结果
2.3.2 在三角褐指藻中的验证 该方法可以在茂源链霉菌中成功进行目的基因的扩增,我们又将该方法应用于低等植物进行PCR 以验证该方法的可行性。在用研磨仪破碎三角褐指藻粗提取基因组DNA 后,我们选取2 个目的基因片段(Δ5-fatty acid elongase 基因长936 bp,acetyl-CoA acyltransferase 基因长1374 bp)对粗提的基因组进行PCR 实验,结果2 个目的基因片段均能从快速提取的三角褐指藻基因组中扩增出来(图4)。
2.3.3 在酿酒酵母中的验证 我们将该方法进一步应用到酵母中。选取酿酒酵母Y1H 作为实验对象,用研磨仪破碎细胞粗提基因组后,同样选取2 个目的片段(CYC1 基因长约300 bp,GPD1 基因加上下游共1577 bp)对粗提的基因组进行PCR,以验证该方法在酵母中的可行性,结果见图5,选取的2 个目的基因均能从粗提的基因组中扩增出目的片段。
基于快速提取的基因组在多个物种中实现目的基因扩增后,我们尝试用该方法提取的基因组进行较大片段的扩增。选取茂源链霉菌中SSTI 基因上下游共4023 bp 的一段序列作为扩增的目的基因,结果见图6,快速提取的基因组虽然被打碎,但对于较大片段的扩增仍是可行的。
图3 茂源链霉菌基因组快速提取PCR 验证结果
图4 三角褐指藻基因组快速提取PCR 验证结果
图5 酿酒酵母Y1H 基因组快速提取PCR 验证结果
图6 茂源链霉菌中较大目的基因片段PCR 验证结果
在分子生物学研究领域,提取样本DNA 是实验的首要任务,目前已有很多成熟的方法[10-11]。DNA 提取的难点又在于怎样更有效率地破除细胞壁,释放里面的DNA,比较常用的方法有液氮研磨、酶解法、反复冻融、沸水浴、玻璃珠研磨、各种成品试剂等,但这些方法均须花费大量的时间、人力和物力,而且很难适用于多个不同样品的一次性提取。在本实验中,我们大胆尝试将机械研磨应用于DNA 提取,对于仅用于PCR 的DNA提取,利用研磨仪可以同时提取64 个样品,研磨时间2 min,加上水浴5 min、离心3 min,整个实验流程下来只需10 min,即可轻松得到PCR 模板,而且实验过程中无需使用有机溶剂,大大提高了DNA 的提取效率,同时也节约了大量时间,不使用有机溶剂更加环保健康,符合发展理念。对于需要测序的DNA 样本,采用研磨仪液氮研磨,可在2 min 内磨好4 个样品,相比于手工液氮研磨,不仅节约了时间,提高了实验效率,而且研磨更加充分,同时也减少了因在研钵里研磨而造成的样品损耗。在茂源链霉菌SSTI 基因敲除过程中,培养皿上长出无数转化子,需要验证目的基因是否被敲除以及敲除效率有多少。由于茂源链霉菌细胞壁较厚且结构紧密,沸水浴、碱裂解、反复冻融均无法达到快速提取基因组DNA 进行PCR 的目的,面对几百个转化子,如果用传统的手工液氮研磨,再加上PCR 验证,至少需要花费1 个月的时间,但采用研磨仪快速提取基因组进行PCR,仅在1 周内就完成了这个巨大的任务。
目前快速PCR 应用于山药、人参等鉴别真伪时[12-13],仍采用传统方法提取总基因组后建立快速PCR,需要花费大量时间,与本实验方法相比仍是繁琐的,且针对单一物种,未在其他物种中验证。王学仁等[14]建立的改进的DNA 提取方法,虽然可用于植物和真菌的DNA 提取,但仍只是在传统方法上进行改进,所花费的时间精力相比于本实验方法仍较多。陈吉良等[15]建立的高效快速提取病原真菌DNA 用于PCR 的方法,相对于传统方法确实简便很多,但还是需要手工液氮研磨,相比较本实验方法的机械研磨无需手工、无需液氮,仍显繁琐。柴海云等[16]用自己配制的DNA 快速提取液可以直接裂解真菌,可用其作为PCR 模板,但有些细胞壁较厚的真菌无法用该方法提取出DNA,而本实验采用研磨仪破碎细胞则不存在类似问题,只要研磨频率够高,再厚的细胞都可以破碎。孙立夫等[17]采用手电钻在冰上研磨细胞,已达到破碎细胞快速提取DNA 的目的,但相比于本实验中采用研磨仪研磨仍是效率低,不安全的。Lõoke 等[18]也在酵母中建立了快速提取基因组DNA 用于PCR 的方法,方法足够简便,利用醋酸锂和SDS 进行裂解细胞,水浴离心,无水乙醇抽提,但该方法仅在酵母中使用,很难适用于细胞壁较厚的非常规物种。
我们用研磨仪对茂源链霉菌进行研磨破碎,不仅建立了快速提取DNA 用于PCR 的方法,同时也建立了快速提取完整基因组DNA 的方法。以研磨仪快速提取的基因组DNA 为模板在茂源链霉菌中扩增目的基因取得成功后,又将该方法应用于三角褐指藻和酿酒酵母,并对同一物种中的2 个目的片段进行扩增,均取得成功。最后,利用快速提取的茂源链霉菌基因组DNA 对4023 bp 的大片段目的基因进行扩增,也成功扩增出目的条带,这充分证明了利用研磨仪研磨提取DNA 进行PCR 的可行性。由于是机械研磨,所以不必考虑细胞壁的组成、厚度等问题,只要频率够高,足以磨碎所有的细胞,因此该方法可以推广到更多的物种,为快速PCR 和提取完整基因组等试验节约大量的人力物力。