尼帕病毒融合蛋白的真核表达及其特异性血清的制备

刘渝娇，李耀辉，张冠英，范鹏飞，迟象阳，房婷，刘树玲，陈旖，宋小红，于长明

军事科学院军事医学研究院生物工程研究所，北京100071

尼帕病毒（Nipah virus，NiV）属于副黏病毒科 （Paramyxoviridae）亨尼帕病毒属（Henipavirus），为单股负链RNA病毒，其自然宿主为果蝠，可感染猪、马等哺乳动物以及人类，能够引起严重的神经系统性疾病和呼吸系统性疾病等[1]。尼帕病毒最早出现于1998 年9 月，该次疫情持续至1999 年4 月，最终造成马来西亚霹雳州256 人感染，105人死亡，另有116 万头猪死亡，并蔓延至新加坡一屠宰场，造成11 名工人感染、1 人死亡[2-3]。1999年10 月，研究人员从一名患者脑脊髓液中分离出病毒[2]。不久之后，又从马来西亚果蝠尿液中分离出尼帕病毒，确定了尼帕病毒的自然宿主[3]。随后，在印度、柬埔寨、泰国等国家都曾报道过尼帕疫情，近年来，尼帕病毒感染疫情多次在孟加拉国和印度发生，已造成数百人死亡，死亡率为50%～100%[4]。

NiV 基因组共编码6 个结构蛋白（N，P，M，F，G，L），有黏附蛋白（G）和融合蛋白（F）2 个包膜糖蛋白。其中G 蛋白是以四聚体形式存在的Ⅱ型跨膜蛋白，胞外域包括一个茎状区以及含受体结合区域的头部区；而F 蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，包含546 个氨基酸残基，相对分子质量约67×103，包括2 段七肽重复序列（heptad repeat，HR）和疏水性融合多肽（fusion peptide，Fp）[5]，其基因位于病毒基因组6370～8706 nt[6]。在F 蛋白合成过程中，首先合成为不具备活性的前体蛋白F0，F0运输至细胞膜表面后，通过内吞作用回到细胞内部[7-8]，然后在酸性核内体中被组织蛋白酶L 或B 分解[9-10]，形成F1（C 端）和F2（N 端）2 个有活性的蛋白，F1和F2通过二硫键连接形成有融合功能的融合蛋白，最终在膜表面以三聚体形式存在[11]。尼帕病毒入侵宿主细胞时，通过G 蛋白识别并结合宿主细胞膜表面受体Ephrin B2 和Ephrin B3[12-13]，这一过程会激发F 蛋白发生显著的构象重排[14]，从一个亚稳定状态重新折叠成为较低的能量状态，从而促进Fp 暴露并插入宿主细胞膜[15]。因此，含有受体结合区的G 蛋白与含有融合肽的F 蛋白经常被作为尼帕病毒结构、入侵机制等研究的主要对象，以及疫苗研制和抗体筛选的重要靶标。

鉴于F 蛋白在病毒入侵过程中扮演着极为重要的角色，表达纯化获得接近天然构象及生物化学性质的F 蛋白以及制备其特异性血清，对于尼帕病毒的疫苗研究、中和抗体的筛选及相关机制探讨至关重要。因此，我们构建了F 蛋白的真核表达质粒，在哺乳动物细胞中表达获得了可溶性F 蛋白（sF），并且验证了纯化得到的蛋白以三聚体的形式存在，且能在体外被胰蛋白酶消化分解为F1和F2蛋白。以该蛋白免疫小鼠，获得了针对尼帕病毒F 蛋白的特异性血清。本研究为后续开展尼帕病毒的蛋白结构、入侵机制、疫苗及中和抗体等相关研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

4～6 周雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；Expi293F 细胞、尼帕病毒G蛋白、抗埃博拉病毒GP 蛋白单克隆抗体由本实验室保存；限制性内切酶XbaⅠ、AgeⅠ，胰蛋白酶购自NEB 公司；去内毒素大提试剂盒购自天根生化有限公司；Expi293 细胞培养基及转染试剂购自ThermoFisher 公司；Strep Trap HP 预装柱购自GE Healthcare 公司；Western 化学发光显色液、30k 15 mL 超滤管购自Millipore 公司；蛋白酶抑制剂购自Promega 公司；山羊抗鼠IgG 二抗（HRP）购自Abcam 公司；抗Strep（HRP）抗体购自Merck Millipore 公司；TMB 单组分显色液、ELISA 终止液购自索莱宝有限公司。

1.2 表达质粒构建

尼帕病毒融合蛋白F 基因（GenBank：NC_002728.1）删除跨膜区和细胞质尾区，仅保留胞外域基因，C 端加上Strep 标签，序列设计完成后由金斯瑞有限公司进行密码子优化并合成，酶切位点为XbaⅠ和AgeⅠ，连接至表达载体pcDNA3.4，得到表达质粒pcDNA-sF。将菌液送至生工生物工程有限公司测序，序列比对确认无误后，振荡培养提质粒pcDNA-sF，在37℃经XbaⅠ/AgeⅠ双酶切1 h 后核酸电泳鉴定。

1.3 融合蛋白F 在哺乳动物细胞中的表达

转染前1 d，接种2×106细胞到30 mL Expi293 表达培养基中，在5% CO2、37℃、120 r/min条件下悬浮培养；转染当天，检测细胞密度达3×106/mL 时，取 80 μL ExpiFectamine293 转染试剂加入1.5 mL MEM 培养基中，取30 μg 表达载体pcDNA-sF 加入1.5 mL MEM 培养基中，分别混匀，室温孵育5 min 后将二者混合，室温孵育25 min 后加入细胞培养瓶中。转染12 h 后，加入150 μL 转染增强剂1 和1.5 mL 转染增强剂2；继续培养84 h，将细胞培养物800 r/min 离心15 min 后再以3000 r/min 离心15 min，收集上清。

1.4 Strep Trap 柱亲和层析纯化蛋白

用0.45 μm 滤膜过滤收集的细胞表达上清，Strep Trap 亲和柱用0.5 mol/L NaOH 再生后，用平衡缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA·2Na）平衡后上样，上样结束后再平衡，然后用洗脱液（1 L 平衡液，2.5 mmol/L 脱硫生物素）洗脱，收集洗脱峰。用30k 超滤管对洗脱峰进行超滤浓缩，同时用PBS 溶液进行换液。

1.5 Western 印迹检测蛋白表达及血清特异性

取纯化后的样品，加入含DTT 的4×SDS 上样缓冲液，煮沸10 min，电泳结束后用金斯瑞转膜仪电转移蛋白到PVDF 膜上；转膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入抗Strep（HRP）抗体（1∶5000）或免疫小鼠血清（1∶2500）室温孵育1 h；用TBST 洗膜后加入羊抗鼠IgG 二抗（HRP）室温孵育1 h；洗膜后滴加化学发光试剂，在化学发光成像系统中曝光。

1.6 F 蛋白的体外酶解实验

在反应体系中加入1 μg 纯化的sF 蛋白、100 ng 胰蛋白酶，用1×缓冲液补至总体积为10 μL，4℃孵育过夜；次日加入1 μL 10×蛋白酶抑制剂终止反应，取10 μL 消化产物加入4×SDS 上样缓冲液，煮沸10 min，通过Western 印迹分析消化产物成分，一抗为抗Strep（HRP）抗体（1∶5000稀释）。

1.7 HPLC 分析条件

HPLC 分析仪为Waters 2695-2487，凝胶色谱柱为TSKgel G3000SWXL；标准液、样品液上样量均为30 μL，流速1 μL/min，上样时间30 min，柱温25℃，流动相为PBS 缓冲液。

1.8 小鼠免疫

将纯化得到的F 蛋白与弗氏佐剂均匀混合，在每只小鼠腹股沟皮下多点注射20 μg（共6只），在第0、14 和28 d 分别免疫，共免疫3 次；第42 d 时取小鼠尾静脉血，常温静置4 h 后8000 r/min 离心10 min，收集上清。

1.9 ELISA 检测抗血清的特异性结合活性

以1 μg/mL 的浓度包被纯化的sF 蛋白，4℃孵育过夜；用PBST 洗板4 次后用ELISA 封闭液于37℃封闭1 h；再次洗板后首孔加入150 μL 稀释比为1∶100 的小鼠血清，其余孔加入100 μL 稀释液，1∶3 稀释，37℃孵育1 h；洗涤后加入1∶10 000的山羊抗鼠IgG 二抗（HRP），37℃孵育1 h；洗涤后每孔加入100 μL TMB 单组分显色液显色6 min，每孔加入50 μL 终止液终止显色，读取D450nm/D630nm值。

2 结果

2.1 F 蛋白表达质粒的鉴定

pcDNA-sF 质粒设计及鉴定结果见图1。表达质粒pcDNA-sF 经XbaⅠ/AgeⅠ双酶切后得到约6000 bp 的pcDNA3.4 载体条带和约1600 bp 的目的基因条带，说明质粒pcDNA-sF 表达质粒含有目的基因。基因测序结果与原序列一致，没有碱基缺失与突变，表明得到了序列正确并成功克隆的表达质粒。

图1 重组质粒pcDNA-sF 的质粒图谱（A）及酶切鉴定（B）

2.2 融合蛋白F 的表达、纯化及鉴定

2.2.1 纯化产物的SDS-PAGE 鉴定 将浓缩换液后的蛋白进行SDS-PAGE 和Western 印迹分析（图2）。SDS-PAGE 结果显示所纯化蛋白相对分子质量约为70×103，稍大于F 蛋白胞外区相对分子质量的理论值61×103，推测是由于F 蛋白上含有5个N 糖基化位点（Asn64、Asn67、Asn99、Asn414、Asn464），使得蛋白质迁移速率减慢；并且结果显示所纯化的蛋白纯度在95%以上。用抗Strep 抗体进行Western 印迹，结果与SDS-PAGE 结果一致，表明表达蛋白含有Strep 标签，说明纯化的蛋白为本研究所设计的蛋白。

2.2.2 胰蛋白酶切鉴定 在sF 蛋白的体外酶解实验中，经胰蛋白酶消化后的sF 蛋白经SDSPAGE 分析分离出2 条大小不一的条带（图3A），与文献报道的F0蛋白经胰蛋白酶消化形成F1和F2蛋白的理论相对分子质量（分别为51×103和19×103）基本一致。进一步用抗Strep 抗体进行Western 印迹，在70×103、51×103左右有明显条带，应为含有Strep 标签的F 蛋白和位于F 蛋白C 端的F1（图3B）。

图2 纯化产物的SDS-PAGE 分析（A）与Western 印迹鉴定（B）

图3 sF 蛋白酶解产物的SDS-PAGE（A）与Western 印迹（B）

2.2.3 HPLC 分析 以已知相对分子质量的尼帕病毒G 蛋白（四聚体，约240×103）、抗埃博拉病毒GP 蛋白单克隆抗体（150×103）为对照，HPLC 分析结果显示本实验表达纯化的F 蛋白保留时间（9.722 min）在G 蛋白（8.610 min）和单克隆抗体（11.094 min）之间，说明重组表达的F 蛋白相对分子质量介于150×103和240×103之间。而单体F蛋白胞外区的理论相对分子质量约61×103，提示本实验表达纯化的F 蛋白以三聚体（190×103）形式存在，其结合方式有待于进一步研究。

2.3 融合蛋白F 的特异性血清验证及其结合活性检测

取小鼠血清，通过Western 印迹验证血清对F蛋白的特异性识别能力（图5A），对照抗原为尼帕病毒G 蛋白。结果显示在F 蛋白泳道上有一条相对分子质量约70×103的条带，而对照抗原处没有条带，表明所制备的鼠抗血清能特异性识别尼帕病毒sF 蛋白。通过ELISA 测定小鼠血清中抗F 蛋白的抗体滴度（图5B），结果显示小鼠血清中抗F抗体的滴度在104以上，表明重组表达的sF 有效地激发了小鼠体液免疫反应，制备的血清结合活性良好，可用于后续研究。

图4 HPLC 分析sF 蛋白的相对分子质量

图5 鼠抗F 蛋白特异血清与F 蛋白的特异性结合（A）及其抗体滴度检测（B）

3 讨论

NiV 是一种烈性病原体，对病原的操作必须在生物安全4 级实验室进行，目前尚无获批的疫苗或抗体治疗药物[4]。F 蛋白在病毒入侵过程中至关重要，并且通过其构象重排促进病毒与宿主细胞的膜融合[11]，而在免疫系统中体液免疫所产生的主要中和性抗体也依赖于F 蛋白的构象。有研究显示，大多数人源呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗体都识别融合前状态也就是未发生构象改变的F 蛋白[16]；Stewart-Jones 等的研究证明稳定地处于融合前状态的F 蛋白在小鼠和恒河猴体内能更好地激发体液免疫反应[17]。因此在关于F 蛋白的大多数研究中，都是以前体蛋白F0为主要研究对象，例如Chan 等制备了尼帕病毒可溶性的以三聚体形式存在的F0蛋白，并鉴定了其生物化学性质、构象及免疫原性都接近于天然F 蛋白[18]；Dang等则以F0为免疫原免疫小鼠后筛选得到具备广谱中和活性的抗F 蛋白的单克隆抗体，该单抗通过抑制F 蛋白的构象改变而发挥中和作用[4]。制备以三聚体形式存在的F 蛋白用于免疫动物筛选尼帕病毒中和性单抗也是本研究的目的之一。

在蛋白表达系统中，对比原核表达系统，哺乳动物细胞能够准确地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能等方面更接近天然蛋白[19]。而分泌表达相较于胞质内表达，经历了蛋白翻译后加工的整个过程，具有简化蛋白产物的检测与纯化、降低生物处理工艺的复杂性、提高蛋白产物的产量与质量等优势[20]。

本研究在哺乳动物细胞中对NiV 融合蛋白F进行了重组表达，获得了可溶性F 蛋白。该蛋白在自然状态下以三聚体形式存在，与天然状态下F 蛋白的存在方式一致，且能在体外被胰蛋白酶消化分解为F1、F2蛋白，具有与天然F 蛋白相似的生物化学性质；将sF 蛋白免疫小鼠后获得了高效价的特异性血清。这些结果为NiV 入侵机制、疫苗设计、中和抗体筛选及作用机制等后续研究奠定了坚实的基础。