串联质谱技术在喀什地区遗传代谢病高危儿筛查中的应用价值

谢金水 陈小娜 毛 莲 赵 青

广东省东莞市第三人民医院儿科，广东东莞 523200

遗传代谢病（inherited metabolic diseases，IMD）是由于组成机体正常代谢所需的酶、受体、载体及膜泵生物合成的多肽（蛋白）的编码基因发生突变，导致机体代谢功能缺陷，而引起一系列临床症状的一类遗传病[1-2]。IMD 的病种繁多，其总体患病率在出生缺陷病中占有重要地位，危害严重，但通过早期筛查，及时诊断和治疗可有效改善患儿预后[3-4]。以往临床筛查IMD多依赖各项实验室检查，操作繁琐、耗时且准确性有限[5]。随着串联质谱技术的不断发展，该技术通过不同同位素内标，实现2 min 内同时检测同一样品中多种目标代谢物，在IMD 筛查中得到了广泛应用[6]。串联质谱对IMD 的检出率在不同地区中存在差异，我国上海地区、河北石家庄地区、广西南宁地区等多地区已相继报道应用串联质谱筛查新生儿或高危儿IMD[7]。但目前新疆喀什地区IMD 筛查工作尚未见报道。本研究应用串联质谱技术对新疆喀什地区521 例IMD高危儿进行筛查，了解喀什地区IMD 的发病种类、发病年龄段和主要临床表现，现报道如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象

2017 年3 月～2018 年12 月新疆喀什地区疑似IMD 高危儿321 例，其中男173 例，女148 例，年龄24 h～12 岁，其中年龄24 h～＜1 个月98 例，1 个月～＜1 岁86 例，1～＜4 岁64 例，4～12 岁73 例。临床主要表现为间断抽搐或惊厥、肌张力异常、黄疸、肝功能异常、拒乳或厌食、呼吸困难、心功能异常、反复呕吐、嗜睡等症状。本研究经高危儿家长或监护人同意，获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 样本采集

采用干血纸片法进行样本采集。采集受试儿手指或足跟血液滴于滤纸片上，形成直径大于1 cm 的血斑，在室温下自然干燥后，置于封口塑料袋内，保存于-20℃冰箱。

1.3 同位素内标

氨基酸内标12 种和酰基肉碱内标8 种均购于美国剑桥公司，使用甲醇稀释各同位素内标至工作浓度，保存于4℃冰箱。氨基酸内标2H4-丙氨酸（生产批号：20140622）、2H5-苯丙氨酸（生产批号：20170106）、2H3-谷氨酸（生产批号：20170319）、2H2-瓜氨酸（生产批号：20170414）、2H8-缬氨酸（生产批号：20170526）、2H3-亮氨酸（生产批号：20170703）、2H3-蛋氨酸（生产批号：20170130）、13C6-酪氨酸（生产批号：20170329）、2H3-天冬氨酸（生产批号：20170501）、2H2-鸟氨酸（生产批号：20170111）、2H4，13C-精氨酸（生产批号：20170207）的工作浓度均为2.5 μmol/L，15N,2-13C-甘氨酸（生产批号：20161227）的工作浓度为125 μmol/L。酰基肉碱内标2H3-乙酰肉碱（生产批号：20170127）和2H3-辛酰肉碱（生产批号：20170214）工作浓度为0.19 μmol/L，2H3-丙酰肉碱（生产批号：20170316）、2H3-丁酰肉碱（生产批号：20170328）、2H9-肉豆蔻酰肉碱（生产批号：20161207）和2H9-异戊酰肉碱（生产批号：20161224）工作浓度为0.04 μmol/L，2H9-游离肉碱（生产批号：20170426）工作浓度为0.76 μmol/L，2H9-2H3-棕榈酰肉碱（生产批号：20170103）工作浓度为0.08 μmol/L。

1.4 方法

1.4.1 样本处理方法 取样本滤纸片，使用打孔器制成直径3 mm 的圆形血片，放入96 孔过滤板（滤膜孔径0.45 μm）中，每孔加入氨基酸同位素内标和酰基肉碱同位素内标溶液各100 μL，室温放置30 min 以洗脱血片中的氨基酸和酰基肉碱。离心至新的96 孔聚丙烯板，使用50℃氮气吹干，每孔加入3 mol/L 的盐酸正丁醇溶液（由正丁醇和乙酰氯按9∶1 配制而成，正丁醇和乙酰氯均为色谱级，购于Millipore 公司，生产批号：17120601、17112407）60 μL，Teflon 膜覆盖后，65℃恒温箱内放置15 min，然后50℃氮气（纯度99.999%）吹干，再加入80%乙腈（色谱级，Millipore 公司，生产批号：18012502）100 μL，铝膜覆盖后，使用API3000 型串联质谱仪（美国ABI 公司）进行检测。

1.4.2 检测方法 流动相为80%乙腈，设置四元泵流速为30 μL/min，每次自动进样量为20 μL。氨基酸扫描方法采用中性丢失扫描和多反应检测，中性氨基酸采用中性丢失扫描，丢失中性碎片质荷比（m/z，即质子数/电荷数的比值）为102Da，中性丢失扫描范围为m/z 140～m/z 280；多反应检测用于甘氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胍氨酸及其内标检测。酰基肉碱检测采用母离子扫描，扫描方式：子离子，m/z85；扫描范围m/z 210～m/z 502。

1.4.3 资料分析及诊断 应用软件Chemo View1.2 进行定量分析，根据各种丁酰化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度和已知浓度的同位素内标，计算所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度。结合常规实验室检查和临床表现，对串联质谱初筛阳性者，重新采血进行复查，若两次筛查均为阳性，则该样本IMD 筛查结果为阳性。

1.4.4 质量控制 本研究参加美国疾病控制和预防中心IMD 筛查质量评价，串联质谱仪操作人员、资料分析和诊断人员均接受专业培训，确保筛查结果准确性和可信性。

2 结果

2.1 IMD 高危儿筛查结果

321 例疑似IMD 高危儿，串联质谱检测阳性17 例，总筛查阳性率为5.30%（17/321）。共涉及IMD 13 种。见表1。

2.2 IMD 阳性患儿发病年龄

17 例IMD 阳性患儿中，1 个月～1 岁发病率最高（8 例，47.06%），其次为24 h～＜1 个月（6 例，35.30%）、1 个月～＜4 岁（2 例，11.76%），4～12 岁发病率（1 例，5.88%）最低。

2.3 IMD 阳性患儿临床表现

24 h～＜1 个月发病患儿主要临床表现有间断抽搐或惊厥、精神行为反应、肌张力异常、嗜睡等；1 个月～＜4 岁发病患儿主要临床表现有生长发育迟缓、喂养困难、黄疸、反复呕吐等；4～12 岁发病患儿主要临床表现有不明原因贫血、肝脾肿大等。见表2。

表1 筛查阳性的IMD 高危儿病种分布

表2 不同年龄段发病患儿临床表现

3 讨论

IMD 可累及神经、脑部、肌肉、内脏等全身多系统和器官，因其临床表现复杂，缺乏特异性症状体征，临床诊断困难[8-10]。以往的酶学、基因测序等实验室指标筛查方法，一次只能检测一种疾病，难以满足IMD 多病种、多范围的筛查需求，且易误诊或漏诊[11]。串联质谱技术是一种特异性和准确性更高的物质定性、定量分析技术，其用于IMD 筛查，可同时测定IMD 高危儿血液中40 余种氨基酸、酰基肉碱和游离肉碱的浓度变化，筛查出氨基酸代谢病、脂肪酸代谢病和有机酸代谢病等多种IMD，并利用已知同位素内标对疾病作为鉴别诊断，具有较高的精密度和准确性[12-13]。

目前，中国多地区已经普及串联质谱IMD 筛查方案，为IMD 预防和治疗提供了可靠依据。串联质谱一次实验可同时检测出同一样品的数十种遗传代谢性疾病，本研究确诊病例的13 种病种以氨基酸代谢病和脂肪酸代谢病为主，也有少数线粒体病病例。袁晃堆等[14]应用串联质谱技术对广东省东莞地区1206 例IMD 高危儿进行筛选，结果检测到12 种IMD，总阳性检出率为4.23%（51/1206）。茂名地区疑似高危儿筛查发现总阳性率为5.67%（206/3632），涉及IMD 7 种[15]。甘肃地区427 例高危样本中阳性率为17.33%（74/427），共涉及8 种IMD[16]。本研究对喀什地区321 例高危儿筛查结果，17 例阳性患儿涉及IMD 13 种，总阳性率为5.30%，可见串联质谱筛查在不同地区具有不同差异。氨基酸代谢病可累及神经系统，导致患儿精神运动发育迟缓、智力减退等，适当氨基酸补充，饮食控制维生素等综合治疗可改善该类病例的神经症状[17]。脂肪酸代谢异常可累及心脏、肝脏，也可产生脑病变和肌肉病变，造成低血糖、呕吐、嗜睡、生长迟缓等症状[18-19]，饮食中应少量多餐，注意补充链脂肪酸、肉碱、核黄素等治疗。

IMD 的病因包括先天基因遗传和后天基因突变，发病期可覆盖各个年龄段，以新生儿和婴幼儿期最为常见。本研究结果，喀什地区IMD 以1 个月～1 岁（婴幼儿期）发病率最高为47.06%，其次是24 h～＜1 个月（新生儿期）发病率为35.30%。24 h～＜1 个月发病患儿中表现为肌张力异常、间断抽搐或惊厥、精神行为反应差、嗜睡。1 个月～＜4 岁发病患儿表现为生长发育迟缓、喂养困难、黄疸、反复呕吐、呼吸困难。4～12 岁发病患儿表现为不明原因贫血、肝脾肿大。IMD 若不及时治疗会有死亡危险，近年来随着IMD 筛查、诊断水平的提高及其发生病理生理机制的深入认识，在患儿首次发作时给予准确筛查、诊断，有助于早期采取有针对性的干预治疗措施，使多数患儿度过危险期，降低患儿致残率和死亡率。

综上所述，串联质谱技术用于IMD 筛查具有效率高、准确、可靠等优势。本研究不足之处在于筛查病例数量较少，未对阳性病例进行随访研究，下一步需继续增加筛查数量深入分析喀什地区IMD 发病特点，进一步提高IMD 筛查效率，为预防和早期诊治IMD，改善IMD 患儿预后提供参考。