新疆地区自然发酵辣椒酱中耐盐乳酸菌的筛选鉴定

武亚婷，杜木英，丁承焱，阚建全，程方方，殷 娜，刘维兵，韩亚楠，何欢欢，尹小庆，武 运*

（1.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆果品精深加工与贮运保鲜工程技术研究中心，新疆 乌鲁木齐 830052；3.西南大学 食品科学学院，重庆 400715；4.中匈食品科学联合研究中心，重庆 400715）

发酵辣椒酱是一种具有特殊风味的乳酸菌发酵制品，有良好的感官品质，其成本低廉、食用方便[1-2]。我国传统辣椒酱多以自然发酵为主，该方法存在容易被污染，难以实现工业化生产，发酵条件难控制，产品品质不稳定的问题[3-4]。而国外主要通过菌种纯培养技术进行多菌种混合发酵或酶法生产优质辣椒酱，产品营养丰富[5-7]。随着人们生活质量和水平的不断提高，采用乳酸菌纯种发酵辣椒酱越来越受到国内外研究学者的关注，因此，优良乳酸菌的筛选具有重要的意义。沙漠等[8]从自然发酵的辣椒酱中分离出两株产酸量高、生长良好且适用于发酵辣椒试验的菌株；周俊良[9]在贵州地区市售泡辣椒和农家自制酱辣椒产品中筛选出4株适用于发酵辣椒制品制作的乳酸菌。

耐盐微生物作为一种新型微生物资源，对发酵产品口感、品质的提高及生产工艺的改善具有非常重要的作用[10]。发酵产品中添加嗜盐微生物对于优化生产工艺、改善盐渍食品口感具有十分重要的意义[11-12]。曲玲童[13]从锦州腌渍小黄瓜中筛选出具有良好发酵性能的耐盐植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），对产品质量提高具有理论支持和实际应用价值。

本试验以新疆部分地区自然发酵辣椒酱为研究对象，首先，在厌氧条件下，采用富集培养法、溶钙圈法等传统培养分离方法对乳酸菌进行初筛；然后，通过测定产酸能力和NaCl耐受能力进行复筛；最后，通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对耐盐乳酸菌进行鉴定。通过筛选获得耐盐乳酸菌，后期将其应用于辣椒酱发酵试验，旨在为开展复合菌强化发酵辣椒酱研究提供优良菌种，为发酵型辣椒酱生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

利用无菌袋，对新疆5个地区农户家自然发酵结束后的辣椒酱进行取样，每个地区取5～10份样品，具体见表1。

表1 新疆发酵辣椒酱样品Table 1 Fermented chili sauce samples from Xinjiang

1.1.2 培养基

MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

改良MRS培养基[14]：称取20 g碳酸钙于100 mL蒸馏水中，制成乳浊液；将MRS琼脂培养基和CaCO3乳浊液在121 ℃条件下灭菌15 min，MRS培养基冷却至50 ℃左右时，加入3%CaCO3乳浊液，混合均匀，凝固。

1.1.3 化学试剂

氯化钠、氢氧化钠、过氧化氢、盐酸、异丙醇、乙醇（均为分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；200 kit细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：上海飞捷生物技术有限公司；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）：加拿大Fermentas公司；TaqDNA聚合酶：日本TaKaRa公司。

1.2 仪器与设备

FA2014N分析天平：北京东南仪诚实验室设备有限公司；HR40-IIA2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XSZ-4GA生物显微镜：上海光学仪器一厂；FE28 PLus pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TU-1810APC分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DYY-7B电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化及筛选

分别称取25 g发酵辣椒酱样品于225 mL无菌水中，振荡，梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，制备菌悬液[15]。

分别吸取稀释度为10-3、10-4和10-5的不同样品稀释液0.1 mL均匀涂布到改良MRS培养基上，37 ℃厌氧培养48 h，采用游标卡尺测定溶钙圈直径及菌落直径。挑取透明圈大的单菌落进行平板划线纯化3次，直至得到纯菌落[16]。将具有溶钙圈的菌株按1%（V/V）接种量接种到MRS肉汤培养基，37 ℃静置培养48 h，以不接种的MRS肉汤培养基为对照，每隔2 h取样，采用紫外分光光度计测定波长680 nm处的吸光度值[17]，根据OD680nm值绘制乳酸菌的生长曲线。采用pH计测定发酵液的pH值并计算产酸率[18-19]。

1.3.2 乳酸菌的耐盐性能测定

由于市售自然发酵辣椒酱中口感较好的样品食盐含量为6%～8%，故选用NaCl含量为1%～11%的范围进行耐盐性能试验[20-22]。将筛选的乳酸菌菌株按1%接种量接入分别含1%、3%、5%、7%、9%、11%NaCl的MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养24 h，测定波长680 nm处的吸光度值，通过比较不同盐浓度条件下乳酸菌的生长状况来指示乳酸菌的耐盐能力[23]。

1.3.3 耐盐乳酸菌的鉴定

形态观察[24]：将筛选得到的耐盐乳酸菌接种于MRS琼脂培养基，37 ℃培养48 h。观察菌落大小、形状、表面、隆起形状、边缘、颜色及透明度等。

生理生化试验[24]：挑取乳酸菌菌落涂片，进行革兰氏染色，油镜下观察菌体形态及其排列方式。挑取乳酸菌进行过氧化氢酶试验、糖发酵试验。

分子生物学鉴定：采用200 kit细菌DNA提取试剂盒提取乳酸菌的基因组DNA，以其为模板，采用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）对菌株的16S rDNA进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR扩增体系：10×Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，上下游引物（25 μmol/L）各3 μL，TaqDNA聚合酶（250 U）0.2 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水（ddH2O）17.8 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至华大基因进行测序。将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank数据库中进行BLAST同源性比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 6.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树[25]。

1.3.4 数据分析

实验中每个处理重复3次，采用SPSS 24进行数据的显著性分析，应用Origin 2018软件和MEGA 6.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离筛选

2.1.1 乳酸菌的分离及初筛

通过改良MRS培养基共分离筛选得到16株能产生溶钙圈的乳酸菌，结果见表2。

由表2可知，菌株S、T、W、R来自伊犁地区样品、菌株B、H、Z来自哈密地区样品、菌株SS、Q、LL、BW来自奇台地区样品、菌株X、Y、L来自阿克苏地区样品、菌株E、YS来自乌鲁木齐地区样品。其中菌株T、SS、B、X、E、Q、S的溶钙圈与菌落直径比较大，因此，选择这7株菌株进行复筛。

表2 乳酸菌的分离结果Table 2 Isolation results of lactic acid bacteria

2.1.2 乳酸菌的复筛

7株初筛菌株的生长曲线见图1，发酵过程中pH值、产酸率的变化见图2和图3。

图1 7株乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of 7 strains of lactic acid bacteria

图2 7株乳酸菌发酵过程中pH值的变化Fig.2 Change of pH value of 7 strains of lactic acid bacteria during fermentation

由图1及图2可知，7株菌株发酵16 h后均处于稳定期。发酵24 h内，菌株SS的OD680nm值最高，pH值最小；菌株T、B、X的OD680nm值相对较高，pH值相对较小；菌株S、Q、E的OD680nm值相对较低，pH值相对较大；而菌株E的OD680nm值最低，生长态势较差，pH值最大。结果表明，菌株SS、T、B、X的产酸能力较强。由图3可知，当发酵16 h时，7株菌株的产酸率均达到最高值，分别为（1.91±0.012）%、（1.88±0.015）%、（1.86±0.020）%、（1.92±0.017）%、（1.97±0.025）%、（1.72±0.025）%和（1.64±0.010）%，且菌株SS、T、B、X的产酸率最高，因此，对菌株SS、T、B、X的耐盐性能进行测定。

图3 7株乳酸菌发酵过程中产酸率的变化Fig.3 Changes of acid production rate of 7 strains of lactic acid bacteria during fermentation

2.2 乳酸菌耐盐性能的测定结果

菌株SS、T、B、X的耐盐性能测定结果见图4。

图4 4株乳酸菌的盐耐受性Fig.4 Salt tolerance of 4 strains of lactic acid bacteria

由图4可知，在NaCl含量为1%～11%范围内，随着NaCl含量的增加，4株乳酸菌的生长明显受到抑制。当NaCl含量为1%～5%，4株乳酸菌能较好地生长；当NaCl含量＞5%之后，乳酸菌的生长明显受到抑制；当NaCl含量＞7%之后，乳酸菌生长极为缓慢，过低的OD680nm值无法满足生产需要。结果表明，乳酸菌SS、B、T、X均可耐受7%NaCl。4株乳酸菌株中，菌株SS的OD680nm值最高，说明盐耐受性最好，菌株T次之，菌株B和X较差，且无显著性差异（P＞0.05）。经过反复传代培养，菌株SS、T、B具有稳定的遗传特性，菌株X遗传特性不稳定。综合分析，菌株SS、T、B为耐盐性能较好的菌株，对其进行鉴定。

2.3 耐盐乳酸菌的鉴定

2.3.1 形态观察

菌株SS、T、B的形态观察结果见图5。

图5 菌株B、SS和T菌落形态（A）和细胞（B）形态Fig.5 Colony (A) and cell (B) morphology of strains B,SS and T

由图5可知，菌株B、T、SS菌落均呈圆形，表面光滑，乳白色，中间突起较白，边缘整齐。在显微镜下观察，菌株B、SS、T都为短杆状，菌株T杆状较粗。

2.3.2 生理生化试验

菌株B、T、SS革兰氏染色均为紫色，呈阳性；过氧化氢酶试验均无气泡产生，呈阴性，糖发酵试验结果见表3。

表3 耐盐乳酸菌的糖发酵试验结果Table 3 Results of carbohydrate fermentation test of salt-tolerance lactic acid bacteria

续表

由表3可知，3株菌株均不能利用鼠李糖，菌株B、SS不能利用木糖，其余试验结果均呈阳性。结合形态观察结果，参考《伯杰细菌鉴定手册》[26]和《常见细菌系统鉴定手册》[27]初步鉴定菌株B、T、SS为乳杆菌（Lactobacillus）。

2.3.3 分子生物学鉴定

菌株B、T、SS的16S r DNA PCR扩增产物见图6。

图6 菌株B、T和SS 16S rDNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.6 Results of agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rDNA of strain B,T and SS

由图6可知，3株乳酸菌的PCR扩增产物的碱基长度均在1 500 bp左右，与预期结果相符。将PCR产物进行测序，采用MEGA 6.0构建系统发育树，结果见图7。

图7 基于16Sr DNA序列菌株B、T和SS的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of strain B,T and SS based on 16S rDNA sequences

由图7可知，菌株B、T、SS与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，亲缘关系最近，结合形态观察结果及生理生化试验的结果，判定菌株B、T、SS均为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

3 结论

采用富集培养法、溶钙圈法等传统方法从新疆部分地区自然发酵辣椒酱中分离纯化得到7株溶钙圈较明显的菌株，根据菌株对NaCl的耐受性和产酸能力，进一步筛选得到3株产酸能力较强、可耐受7%NaCl的菌株，分别为SS、T、B。通过形态观察、生理生化及分子生物学技术鉴定3株耐盐乳酸菌均为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。综合3株菌的耐盐能力、产酸能力，下一步工作将围绕植物乳杆菌在自然发酵辣椒酱品质形成中的作用机制，研究植物乳杆菌与产香酵母等多菌种混合接种发酵的工艺，并进一步明确植物乳杆菌在辣椒酱品质形成中的作用机制及植物乳杆菌在辣椒营养物质转化的作用等。