温阳健脾祛痰颗粒含药血清对非酒精性脂肪性肝病细胞模型TLR4／TRIF／NF-κB通路的影响

李 晖 ，张泽凤 ，2，杨 超 ，林俊芝 ，赵梓亦 ，陈昌金

（1.成都中医药大学附属医院中心实验室，四川 成都 610072；2.成都中医药大学临床医学院，四川 成都 610072；3.广东省中医院，广东 广州 510120）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遗传-环境-代谢应激相关性肝病，包括单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）［1］。 目前，NAFLD 已成为慢性肝病的主要病因，西方发达国家NAFLD发病率约为20%～30%，其中20%进展为肝硬化［2］；亚洲发病率为5%～18%，我国发达地区发病率亦达到15%左右［3］。 NAFLD 发病机制复杂［4-6］，现代医学目前对NAFLD尚无特效的治疗药物，主要采取生活方式干预、胰岛素增敏剂、抗氧化剂等治疗措施［7］，干预作用有限，针对不同靶点及多层次靶向联合治疗是进行NAFLD干预的方向。中医药具有多途径、多层次、多靶点综合药理作用的特点，在治疗NAFLD方面具有优势［8］。 温阳健脾祛痰颗粒（WYJPQT）是笔者经验方，作为协定处方在临床上应用多年，对于NAFLD的治疗取得了良好疗效，且价格低廉，但需要进一步明确其作用机制。

本研究在应用HepG2细胞建立NAFLD细胞模型的基础上，研究WYJPQT含药血清对该细胞模型的治疗作用。由于慢性炎症在NAFLD发生、发展过程中发挥重要作用，TLR4／TRIF／NF-κB 信号通路是体内重要炎症通路，与NAFLD的进展具有明确的联系，以此为切入点，进一步探讨WYJPQT与TLR4／TRIF／NF-κB信号通路的相关性，明确其作用靶点，为推广WYJPQT的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞株 Wistar雄性大鼠70只，体质量（220±20）g，购自成都达硕实验有限公司，SPF级，动物生产许可证编号：SCXK（川）2015-030；在温度（25±2）℃，12 h光照／d条件下，普通饲料，清水饲养于成都中医药大学附属医院实验动物房适应性喂养1周，大鼠无死亡，一般情况良好。肝癌细胞株HepG2由中心实验室保存。

1.1.2 实验药物 温阳健脾祛痰颗粒（WYJPQT）系笔者经验方，作为协定处方使用多年，由成都中医药大学附属医院药剂科制备为颗粒剂，主要由淫羊藿、炙黄芪、茯苓、炒白术、泽泻、陈皮、法半夏、焦山楂、丹参等组成。制备方法：全方药物加入8倍量水，浸泡 40 min，煎煮 3次，每次 50 min，合并 3次滤液，浓缩至相对密度1.3；加入糊精，混合，在75℃下鼓风干燥6 h，粉碎过筛；加入80%乙醇，制粒，65℃下鼓风干燥4 h，整粒，分包装至10 g。阳性对照药物多烯磷脂酰胆碱胶囊（赛诺菲北京制药有限公司），购于成都中医药大学附属医院。

1.1.3 实验试剂及主要仪器 DMEM培养基、胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）；油酸（Oleic acid，OA，美国MP公司）；油红O、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；BCA蛋白检测试剂盒（美国Thermo公司）；三酰甘油（TG）检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；异丙醇（成都科龙化工试剂厂）；4%多聚甲醛（天津市进丰化工有限公司）；Toll样受体 4（TLR4）上下游引物为 F：5'TTCACTTCCTCTCACCCTTT 3'，R：5'GCATCATCCTCACTGCTTC 3'；核因子 κB（NF-κB）上下游引物为F：5'TCATCCACCTTCATTCTCAAC 3'，R：5'ATCCTCCACCACATCTTCC 3'；髓样分化因子88（MYD88）上下游引物为 F：GCTGACTTGGAGCCTG ATTC；R：GATAGGCATGTCAGGGGAGA；Toll样白介素-1受体结构域适配子诱导干扰素-b（TRIF）上下游引物为 F：CAGGAGCCTGAGGAGATGAG，R：CTG GGTAGTTGGTGCTGGTT；内参β-actin上下游引物为 F：5'TCTCCCAAGTCCACAAGG 3'，R：5'GGGCA CGAAGGCTCATCA 3'；TLR4多克隆抗体（英国Abcam公司，ab13556）；TRIF单克隆抗体（英国Abcam公司，ab180689）；MYD88单克隆抗体（英国 Abcam公司，ab133739）；NF-κB 单克隆抗体（美国 CST 公司，#6956）；CO2培养箱（美国 Nuare 公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；实时荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems公司，型号：ABI 7500）；超纯水仪（法国Milipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备 将Wistar雄性大白鼠70只随机分成WYJPQT高、中、低剂量组，阳性对照组及空白对照组，每组各14只。以上5组大鼠中，除空白对照组外，均予以药物干预，其中，WYJPQT高、中、低剂量组服用 WYJPQT 生药 8.8、4.4、2.2 g／（kg·d），将颗粒稀释后等体积灌胃；阳性对照组予多烯磷脂酰胆碱胶囊 0.122 g／（kg·d）；每日药量分 2 次灌胃，间隔8 h；空白对照组予生理盐水，连续7 d。标本采集前，所有大鼠禁食12 h；于末次给药1 h后，采取下腔静脉取血的方式，收集全血，4℃静置过夜后离心，4 000 rpm×15 min，取血清，56℃ 30 min灭活，以除去可能存在的生物活性物质对实验结果的影响，0.22 μm过滤器过滤除菌，-80℃保存备用。

1.2.2 NAFLD细胞模型的制备及鉴定 HepG2细胞用含10%FBS的DMEM完全培养基，置于5%CO2孵箱中，37℃培养，观察细胞形态变化，待细胞汇合度为70%～80%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3传代，将处于对数生长期的HepG2细胞以1×105个／孔接种于12孔培养板中，细胞贴壁后，弃掉原有培养液，加适量PBS缓冲液洗两遍；模型组加入含0.25 mM OA的培养基继续培养24 h。

取对数生长期的HepG2细胞以1×105个／孔接种于12孔培养板中，吸弃培养孔的培养基，预热的PBS洗3次，每次约5 min；用预热的4%多聚甲醛固定30 min，弃多聚甲醛液，PBS洗2次，每次2 min；每孔加入60%异丙醇同步化液 1 mL 1～2 min，加入油红O工作液每孔1 mL室温下避光放置30 min；吸弃油红O工作液，每孔加入1 mL 60%异丙醇进行分色约30 s；每孔加入1 mL双蒸水（ddH2O）洗3 min，每孔加入1 mL苏木素染色3～5 min，每孔加入 1 mL ddH2O洗 3次，每次 2 min；每孔加入1 mL ddH2O液封，倒置显微镜下观察，取不同倍数不同视野拍照。BCA蛋白检测试剂盒检测细胞内蛋白含量，按说明书操作；三酰甘油检测试剂盒检测细胞内三酰甘油（TG）含量，计算细胞内TG／蛋白比值。

1.2.3 含药血清处理NAFLD的细胞模型 将对数生长期的HepG2细胞以5×104个／孔的密度接种于24孔细胞培养板中，培养24 h后，待细胞汇合度为70%～80%时，吸弃培养基，NAFLD模型组给予含0.25 mM OA培养基造模24 h后，吸弃培养基，用PBS清洗每孔细胞两遍后，将NAFLD细胞模型随机分为5组（WYJPQT高、中、低剂量组，阳性对照组，模型组），同时设置空白对照组，每组4个复孔。WYJPQT高、中、低剂量组分别加入相对应的不同浓度10%WYJPQT含药血清培养基处理48 h，阳性对照组给予10%多烯磷脂酰胆碱含药血清培养基处理48 h，模型组和空白对照组则给予含10%大鼠血清培养基处理48 h后，分别进行油红O染色和细胞内TG含量、蛋白含量测定，确定TG／蛋白比值。

1.2.4 逆转录-实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测细胞中的 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA表达情况 收集细胞，抽提细胞总RNA，mRNA逆转录为cDNA，进行定量PCR检测。设定20 μL体系，包括 cDNA 4 μL、Forward primer （F1） 0.5 μL、Reverse primer （F2） 0.5 μL、SYBR®Green PCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 5 μL，反应条件为预变性95℃ 10 min；变性95℃ 15 s；退火、延伸60℃ 1 min，共40个循环。以β-actin为参照基因，观察CT值的变化，测基因表达相对含量。各组基因相对表达含量计算公式：ΔCT＝目标基因-内参基因，ΔΔCT＝ΔCT（实验组）-ΔCT（空白对照组），计算 2-ΔΔCT（实验组包括 WYJPQT 高、中、低剂量组，阳性对照组，模型组）。

1.2.5 蛋白印迹法（Western blot）检测细胞中TLR4、MYD88、TRIF、NF-κB蛋白的表达情况 RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转移至PVGF膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗、二抗孵育，经ECL发光，X线胶片曝光、显影及定影，并以计算机图像扫描进行图像分析，测定灰度值以代表蛋白的表达量。

1.3 统计学方法 用SPSS 21.0统计软件分析。若各组满足正态分布、方差齐，同一指标间可采用单因素方差分析；组间两两比较，可采用LSD－t检验或非参数检验。

2 结 果

2.1 WYJPQT含药血清处理NAFLD细胞模型后的油红O染色结果 0.25 mM OA诱导HepG2细胞24 h，油红O染色发现，空白对照组细胞边缘清晰，胞浆丰富，核膜完整，细胞核被染成蓝色，细胞内未见明显红色脂滴；而模型组细胞内出现很多大小不等的红色脂滴，脂肪变严重，部分甚至融合成片，确定NAFLD细胞模型成功建立。含药血清处理48 h后，油红O染色示，空白对照组细胞胞膜光滑，细胞核染成蓝色，细胞内未见明显红色脂滴颗粒；模型组，WYJPQT高、中、低剂量组，阳性对照组中细胞核被染成蓝色，细胞内均出现红色脂滴颗粒。与模型组相比，WYJPQT高、中、低剂量组及阳性对照组细胞内红色脂滴颗粒略微减少；WYJPQT高、中、低剂量组与阳性对照组相比，细胞内红色脂滴颗粒数差异不明显，见图1。

2.2 6组TG／蛋白比值比较 0.25 mM OA诱导HepG2细胞24 h，检测细胞内TG／蛋白比值变化，与空白对照组比较，模型组细胞内TG／蛋白比值明显增高，确定NAFLD细胞模型成功建立。WYJPQT高、中、低剂量含药血清处理48 h后，各组TG／蛋白比值见表1。

2.3 6 组 TLR4、TRIF、MYD88 和 NF-κB mRNA 相对表达水平结果 见图2。

2.4 6组 TLR4、TRIF、MYD88和 NF-κB 的蛋白相对表达水平结果 见图3。

图1 6组NAFLD细胞模型的油红O染色图（×400）

表1 各组TG／蛋白比值比较（）

表1 各组TG／蛋白比值比较（）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与阳性对照组比较，3） P＜0.05。

TG／蛋白比值 ／（mmoL／gprot）1.17±0.24 3.18±0.291）2.46±0.292）3）2.51±0.222）3）2.19±0.252）1.97±0.222）组别空白对照组模型组高剂量组中剂量组低剂量组阳性对照组

图2 6组TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB mRNA相对表达水平结果图

3 讨 论

NAFLD隶属于中医学的“胁痛”“痰证”“瘀血”“积聚”“肥气”“肝癖”等范畴。清代叶天士指出：“夫肌肤柔白属气虚，外似丰溢，里真大怯，盖阳虚之体，惟多痰多湿……”，阐明肥胖人多为本虚标实——气虚阳虚为本、多痰多湿为标。该病主要由饮食不节或体虚湿滞，导致肝失疏泄，脾失健运，肾虚气化不及，以致痰湿内生，脂膏沉积于肝。脾虚是本病的发病基础，痰湿为致病因素，本虚标实为病机特点［9］。

图3 6组TLR4、TRIF、MYD88和NF-κB的蛋白相对表达水平结果图

WYJPQT是以“脾肾亏虚，痰湿内蕴”为病机学说，以“温阳健脾，祛痰化湿”为基本治则，六君子汤合泽泻汤加减化裁而形成。由六君子汤是在四君子汤的基础上加入半夏和陈皮，补气健脾，燥湿化痰；而泽泻汤出自医圣张仲景《金匮要略》，为治疗痰饮水湿证经典方剂。两方合用，痰湿得除，脾得健运，标本兼治。WYJPQT全方配伍得当，首重健脾益气祛痰湿，做到“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。脾气旺，则痰湿生化无源。配伍淫羊藿，健脾补肾同时助阳化气，阳气盛则浊阴消，体现了标本兼治的原则。

本研究选用OA诱导HepG2细胞建立NAFLD细胞模型。NAFLD的细胞模型目前主要是通过利用不同比例浓度的油酸、棕榈酸、脂肪乳等来诱导HepG2、L02、Huh7 等细胞建立模型［10-11］。 大量的实验证明：HepG2细胞虽然是肿瘤细胞，但和正常肝细胞在生物学特点和功能上存在相似性，具备肝脏各种细胞特性，油酸、棕榈酸等诱导剂都可以促使肝细胞和HepG2细胞发生脂肪变性。相比而言，HepG2细胞对脂毒性的耐受力更强，因此是脂肪变性细胞模型中最具优势和前景的备选细胞［12］。目前利用OA诱导HepG2细胞建立NAFLD细胞模型已属于比较成熟的方法。本研究采取0.25 mM OA诱导HepG2细胞24 h，采用油红O染色后，发现OA诱导组细胞内可见大小不等的红色脂滴颗粒，部分融合成片，细胞脂质蓄积明显；检测细胞内TG含量，OA诱导组细胞内TG／蛋白比值明显高于空白对照组，说明0.25 mM的OA刺激HepG2细胞24 h构建NAFLD细胞模型成功。

本研究结果显示：WYJPQT高、中、低剂量含药血清和阳性对照组均能降低NAFLD细胞中TG／蛋白比值，从而改善NAFLD细胞内脂质蓄积的状况；WYJPQT低剂量组降低TG的作用与阳性对照组相当。

本研究应用OA刺激HepG2细胞，大量脂肪酸进入细胞内，游离的脂肪酸刺激TLR4产生，通过TRIF或MYD88信号通路向下传递激活NF-κB，使炎症因子IL-6、TNF-α等炎症因子大量释放，导致TG的沉积，从而引起肝细胞脂肪变性、坏死［13-16］。以此为出发点，我们分别应用RT-qPCR法和Western blot法检测细胞内 TLR4、TRIF、MYD88 及 NF-κB mRNA和蛋白的表达情况，结果显示，与模型组相比，WYJPQT高、中剂量组能够显著下调TLR4 mRNA表达，优于阳性对照组；高、中、低剂量组均能降低NF-κB mRNA表达量，中、低剂量组与阳性对照组作用相当。表明WYJPQT含药血清能够降低NAFLD细胞模型中TG／蛋白比值，其机制之一可能与下调TLR4基因表达量，抑制NF-κB的活性有关。而Western blot法检测结果与RT-qPCR法结果不完全一致：模型组TRIF、MYD88蛋白表达量较空白对照组明显上调；与模型组比较，WYJPQT高、中剂量组TRIF蛋白表达量明显下调，高剂量组TRIF蛋白表达量与阳性对照组相当；WYJPQT各剂量组NF-κB相对蛋白表达量出现显著下调，而MYD88相对蛋白表达量则明显升高。

因此，可以初步得出以下结论：WYJPQT对NAFLD细胞模型具有治疗作用，降低细胞内TG／蛋白比值，降低TRIF、NF-κB表达量；而对于TLR4的影响主要集中在mRNA水平，对蛋白表达水平影响不明显，其原因可能跟TLR4／NF-κB信号通路在不同的细胞发挥不同的作用有关［14］；WYJPQT各剂量组MYD88的表达水平呈现升高态势，因此WYJPQT主要通过调控TLR4／TRIF／NF-κB信号通路达到对NAFLD细胞模型的治疗作用，对MYD88的表达影响则需要深入进行验证。

NAFLD发病机制非常复杂，本研究仅对其中TLR4／TRIF／NF-κB信号通路进行了初步探讨。后续研究考虑在动物实验模型上验证WYJPQT的疗效，深入探讨其作用机制，为临床上应用WYJPQT治疗NAFLD提供可靠依据。