胰岛素合成异常与内质网应激

李昱芃 综述 冯文利 审校

近年来，糖尿病成为危害人类健康的最常见疾病之一。2010年数据统计显示，糖尿病患病率已达到11.6%，有50%的成年人正处于糖尿病前期[1]。胰岛β细胞功能异常是糖尿病发病的重要病理机制，胰岛素合成绝对和(或)相对缺乏是各型糖尿病发生的关键原因[2]。内质网是细胞内蛋白质合成折叠、修饰加工与质量监控的重要场所，其稳态平衡对于维持正常的细胞功能有重要意义。胰岛素是在内质网中完成加工，内质网功能正常对于胰岛素的正确生物合成加工及折叠，发挥正常生理功能至关重要。

1 胰岛素的生物合成机制

胰岛素基因经转录翻译形成前胰岛素原，由信号肽、胰岛素B链、C肽和A链组成。前胰岛素原在信号肽引导下，跨膜转位进入内质网，随后信号肽被切除，形成胰岛素原[3]。在内质网腔中，胰岛素原在分子伴侣协助下完成氧化折叠，形成3对高度保守的二硫键(B7-A7、B19-A20和A6-A11)，其正确配对在胰岛素完成正确折叠、达到其正常空间构象的过程中起着至关重要的作用[4]。正确折叠的胰岛素原以二聚体形式出内质网，被转运至高尔基体后，形成六聚体，并在激素原转化酶作用下，切掉C肽后，形成成熟的胰岛素分子。

2 折叠异常的胰岛素原形成

正常生理过程中，可有15%新合成的胰岛素原出现错误折叠[5]，错误折叠的胰岛素原可被内质网中的蛋白质量控制系统识别，进行再折叠达到正常空间构象，对于再折叠后结构仍不正常的胰岛素原，细胞将通过内质网相关降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)或自噬系统降解[6, 7]。诸多原因可引起胰岛素折叠异常，结构异常的胰岛素前体可大量增多，堆积于内质网，导致内质网蛋白稳态失衡，从而引起内质网应激加重，形成对β细胞的“二次打击”，加速β细胞功能的衰竭[2]。

3 胰岛素原折叠异常引起内质网应激相关信号通路

折叠异常的胰岛素原超出ERAD或自噬机制的处理能力，发生内质网应激，启动非折叠蛋白质反应(unfolded protein response，UPR)，细胞通过减少基因的转录翻译，减少蛋白质合成，降低进入内质网的蛋白量，增加内质网中分子伴侣表达，增加内质网的蛋白质折叠作用，并上调内质网的蛋白质降解途径，减少折叠异常蛋白在内质网的堆积。蛋白质正确折叠需要内质网中的分子伴侣及折叠蛋白参与，主要有糖调节蛋白GRP78、钙联接蛋白/钙网织蛋白(CNX/CRT)及巯基氧化还原酶。

GRP78也称为免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)，是内质网中的重要分子伴侣。Bip与待折叠多肽片段相互作用形成结合—解离循环。该循环中Bip与ATP形成复合物，DnaJ与待折叠多肽形成复合物，通过J结构域与Bip发生接触，形成Dnaj-Bip-ATP-多肽复合物。DnaJ可激活Bip的ATP酶活性，使其脱去1分子磷酸，形成DnaJ-Bip-ADP-多肽复合物，降低多肽与Bip的亲和力，释放该多肽[8]。正常情况下，Bip与内质网上的PERK、IRE1、ATF6结合，使其处于未激活态。但是当未折叠蛋白大量增加时，Bip与上述三种蛋白结合减少，激活了这些蛋白及UPR。

目前已知的UPR信号通路包括[7, 9, 10]：PERK-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)-活性转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)-CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein homologeus protein，CHOP)、肌醇依赖跨膜激酶/核酸内切酶1(inositol-requiring transmembrane kinase/endoribonuclease 1，IRE1)-X 盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)和活性转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。这三个通路协同内质网中感应蛋白负荷、蛋白折叠能力、共同调节基因表达及蛋白修饰，以满足ER蛋白折叠的需求[11]。在胰岛β细胞中，PERK- eIF2α-ATF4-CCAAT/ CHOP通路可以迅速减少胰岛素生物合成，减轻内质网高负荷引起ER Stress。IRE1-XBP1及ATF6通路可提高前述ER分子伴侣的基因转录，增加蛋白转运折叠的能力。

3.1 PERK- eIF2α-ATF4-CCAAT/CHOP通路 蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)属于内质网I型跨膜蛋白，有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，也称为elF2α激酶3，是最早发现的与β细胞功能紧密相关的ER感应蛋白[12]，PERK可以特异性地磷酸化eIF2α的Ser51位点,进而抑制胞内蛋白合成，PERK介导的eIF2α磷酸化是胰岛素原生物合成的重要负调节环节。但并非我们推测的PERK活性下降，可以增加胰岛素原合成，对β细胞功能有益，缺乏PERK可导致Wolcott-Rallison综合征，引起新生儿糖尿病[13]。PERk敲除可引起胰岛素原过度合成引发胰岛素原错误折叠增加，进而导致β细胞凋亡[14]。但也有研究报道在PERK敲除的小鼠中，β细胞凋亡并未增加，只是在胚胎期和新生期β细胞增殖受到抑制[15]。有研究发现在PERK缺陷的β细胞中，总蛋白及胰岛素原合成并未脱抑制，胰岛素原蓄积导致的ER应激可能并非是由于过度合成[16]，可能的解释是胰岛素原出内质网的出口及远端分泌间隔被阻滞，此外，质量控制系统及ERAD异常也导致胰岛素原和其他的分泌蛋白及膜蛋白在ER蓄积。在PERK缺陷细胞中，胰岛素原和疱疹性口炎病毒(VSVG)的转运被阻滞，错误折叠蛋白出内质网的重新转位机制(ERAD的重要环节)也被阻断，大量胰岛素原蓄积在内质网，提示了ERAD途径功能异常[16]。

总之，PERK介导的eIF2α磷酸化在胰岛素原合成、折叠、转运以及内质网质量控制中有重要作用[17]，具体机制有待进一步深入研究。eIF2α的Ser51位点磷酸化可进一步激活ATF4的转录，ATF4可增加GADD34的转录，该蛋白可发挥反馈调控作用，抑制eIF2α磷酸化，恢复正常的蛋白合成。ATF4同时还可增加CHOP(也被称作GADD153)的转录，该蛋白的增多可导致细胞死亡。细胞因子及棕榈酸作用于ATF4及AP-1调节CHOP表达[18]，但与SERCA泵抑制剂环匹阿尼酸不同，ATF4不通过内质网发反应原件(ERSE)调节CHOP。CHOP还可以激活ERO1和死亡受体(DR)5等，ERO1编码内质网氧化酶[19]，DR5编码的死亡受体可以激活caspases蛋白级联反应，促使细胞凋亡[20]。GADD34可与蛋白磷酸酶2C结合能促进eIF2α去磷酸化，增加内质网伴侣蛋白的生物合成[21]。CHOP可与cAMP反应原件结合蛋白CREB形成二聚体抑制Bcl-2表达，增加线粒体对促凋亡因素的敏感性[22]。

3.2 IRE1-XBP1通路 IRE1作为一种跨膜激酶和核酸内切酶，对内质网稳态有重要作用。在哺乳动物存在α、β两个亚型，二者均可被内质网中未折叠蛋白的蓄积而激活。IRE1α普遍存在于组织细胞中，在胰腺和胎盘尤其高表达，IRE1β在肠上皮细胞特异表达。内质网应激可以引起IRE1与Bip解离，IRE发生自身磷酸化，激活自身核酸内切酶活性[23]，其底物是XBP1的mRNA，XBP1mRNA被切割下一个26个核酸的内含子后成为成熟的mRNA，其编码的XBP1可与涉及蛋白折叠的靶基因的内质网应激反应原件结合，如Bip，可增加其转录活性[12]，并可上调ERAD相关组份。但敲除IREα及β并未减少Bip及GRP94等UPR靶基因的转录活性，提示其还被其他内质网应激反应因子调控[24]。β细胞中IRE1α的激酶活性可被葡萄糖激活。但是葡萄糖诱导的IRE1α磷酸化与其和Bip的结合及解离无关，提示了其特殊的调控机制。短期高血糖可选择性激活IRE1α的磷酸化，增加胰岛素生物合成，但长期高血糖会导致其激酶和核酸内切酶活性均增高，导致高糖毒性和β细胞衰竭[25]。在长期严重内质网应激时，IRE1α催化活性受到复杂的调控，并引起内质网应激介导的ins mRNA减少和β细胞凋亡[26]。研究发现，脚手架(Scaffold)蛋白RACK1以分子开关的方式，在胰岛β细胞中内质网应激(ER stress)信号通路的动态调控中发挥关键作用，葡萄糖刺激下，IRE1α可与RACK1相互作用，而RACK1可与蛋白磷酸酶PP2A结合，高糖刺激下形成RACK1、PP2A和IRE1α复合物，使IRE1α去磷酸化调控其激活水平，长期高糖刺激或ER应激条件下，PP2A与RACK1解离，使得与RACK1结合的IRE1α磷酸化水平稳定不变，提示RACK1在维持ER稳态中的重要作用[27]。IRE1在内质网应激时可募集肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，并与之结合，TRAF2可以使死亡受体DR及JNK和应激激活蛋白激酶(SAPK)偶联，进一步激活凋亡信号调节激酶1(ASK1)[28]，诱导细胞凋亡。TRAF2还可以切割caspase12，激活caspase3、9，引起细胞凋亡。在caspase12敲除的细胞中，内质网应激不能诱导其凋亡，提示了其是内质网应激诱导凋亡的特异性调节因子[29]。近期发现一个称为KIRAs(Kinase-inhibiting RNase Attenuators)的小分子家族，可以使Akita小鼠的胰岛素合成和分泌增加[30]。

3.3 ATF6通路 ATF6是内质网Ⅱ型跨膜糖蛋白，分子量90 ku。N端胞内区有一个碱性锌指结构(bZIP)的DNA转录激活域，C端管腔内结构区可感受内质网应激。ATF6转移至高尔基体内后，在高尔基体内，ATF6被蛋白水解(site-1 protease、site-2 protease)处理，释放N端的50 ku结构域，然后该结构域转移入核，扮演转录因子的角色，调控Bip、GRP94、ERO1β等内质网应激反应基因，及HERP等ERAD组份[31, 32]。在体外培养的β细胞中，敲除ATF6可导致JNK、p38、C-Jun磷酸化增加，并使细胞容易发生凋亡。抑制JNK或p38磷酸化可防止ATF6缺陷相关的凋亡，表明即使在无氧化应激情况下，ATF6在维持β细胞生存方面也起着重要作用[33]。但是，在小鼠体内大范围敲除ATF6α，虽然在高脂饮食条件下，小鼠存在糖耐量减低，胰岛素含量轻度下降，但在正常饮食条件下没有检测到β细胞功能异常或糖尿病表型[34]。这些都表明在应激条件下，ATF6发挥重要作用。ATF6诱导表达CHOP/GADD153，在非应激条件下，CHOP主要存在于胞浆，表达量较少，应激状态时大量表达，并进入细胞核内[35]。在内质网应激时，敲除CHOP的细胞凋亡较wild type细胞明显减少，而其过表达的细胞，则凋亡增加[22]。CHOP可激活GADD34、ERO1及DR5等凋亡蛋白，诱导凋亡发生。

4 未折叠胰岛素原的降解途径

在β细胞蓄积的错误折叠胰岛素原主要通过泛素-蛋白酶体系降解，泛素化如同给错误折叠的胰岛素原贴上标签，以利于进一步降解处理。该过程有泛素激活酶E1、E2、E3共同完成，是一个级联反应。当错误折叠的胰岛素原诱发UPR，也同时启动ERAD，有许多内质网分子伴侣如Bip/GRP78、EDEM1、OS9及STP3B可能参与错误折叠的胰岛素原的识别和招募到ERAD复合体，这些分子伴侣以糖基化或非糖基化形式与未折叠胰岛素原结合，再将其转运到Sel1L-Hrd1 ERAD复合体[36-38]。

Hrd1可以与Sel1L(又称Hrd3)形成复合体负责错误折叠胰岛素原的降解。Hrd1胞浆侧尾部有一个有E3连接酶活性的指环状催化结构，以及一个长的富含脯氨酸的C端。Hrd1的跨膜区域可形成一个逆转位通道，排出蛋白[39]。随着逆转位到胞浆，错误折叠的胰岛素原被泛素化，在P97(VCP/CDC48)的帮助下，被蛋白酶体降解。指环结构有两个作用：(1)作为其Hrd1依赖的auto泛素化通道功能的门户[39]。(2)Hrd1催化错误折叠底物的泛素化一旦暴露于胞浆，即被打上标签，以便于被蛋白酶体降解。近期研究提示，另一个E3连接酶gp78(可能位于Sel1-Hrd1复合体的下游或平行)可以促进逆转位的蛋白底物的溶解度[40]。

Hrd1活性可被多种机制调节。除了被胞外信号转录介导，两个最重要的调节机制是Hrd1自身泛素化及与Sel1L相互作用[41]。Sel1L是一个跨膜蛋白，可以形成二聚体或寡聚体与Hrd1的N端区域相互作用[42]。Sel1L在哺乳动物的Hrd1 ERAD复合体可能不是必须的，是维持Hrd1稳定所必须的，可以和Hrd1发生相互作用，也为Hrd1招募底物[43]。Sel1L缺失会导致成年小鼠在3周内死亡，并伴有严重胰腺萎缩；Sel1L缺失还会引起Hrd1不稳定及内质网应激，促使胰腺细胞死亡；并导致核糖体大小亚基聚合，减少蛋白质翻译[44]。

错误折叠的胰岛素原是诱发β细胞内质网应激的重要分子基础，UPR及其诱发的细胞凋亡，ERAD均参与了内质网应激信号通路，有一些机制尚不明确。降低内质网应激可缓解β细胞功能衰竭，靶向干预内质网应激可能成为糖尿病治疗的新靶点。4-苯基丁酸、牛磺脱氧胆酸等分子伴侣均可降低内质网应激，减轻β细胞损伤[45]。此外，提高ERAD及细胞自噬效率，上调UPR下游信号通路也可增加β细胞对错误折叠胰岛素原的处理能力(如增加XBP-1、调节Perk-eIF2α通路等)，也可减少错误折叠的胰岛素原在内质网堆积，进而缓解内质网应激。深入的了解胰岛素错误折叠与内质网应激的相关机制，对于更深刻理解糖尿病的发病机制及发现治疗新靶点有重要意义。