环状RNA调控结肠直肠癌的研究进展

潘 成， 屈 潇 综述 秦环龙，2 审校

（1.同济大学医学院肠道疾病研究所，上海 200072；2.同济大学附属第十人民医院胃肠外科，上海 200072）

1976年，Sanger等［1］在植物类病毒中发现一种单链环状RNA(circular RNA,circRNA)。其结构无线性RNA的5′帽子和3′多聚A尾［poly(A)］，而是以共价键首尾连接形成闭合环状，命名为circRNA。此后，在酵母菌、小鼠精子细胞及果蝇中均发现类似结构分子［2-3］。但受技术所限，均将其视为前体 mRNA(precursor mRNA，pre-mRNA)加工过程中的副产物。2012年，Salzman等［4］利用转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)技术发现circRNA在人类细胞中广泛地表达，才重新认识这类分子。近年来circRNA的生物功能及其在多种疾病中的致病机制不断被揭示，成为目前核酸分子研究领域的新热点。

circRNA生物学特征

一、circRNA的分类及合成方式

目前在人类细胞中已鉴定出10万余种circRNA。其大小不一，长可达 4 000 nt，短则小于100 nt，多数在500 nt左右［5-6］。根据来源基因位点不同，主要分 3 类［5-7］。①外显子来源的 circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)：含量最多，约占所有类型分子的80%，主要位于细胞质。由一个或多个外显子以3′，5′-磷酸二酯键首尾拼接而成。其中，一些分子可能为pre-mRNA经选择性剪接后产生的线性mRNA的同分异构体。②外显子-内含子来源的 circRNA(exon-intron circRNA，EIcircRNA)：主要位于细胞核，由外显子及其间的内含子构成。③内含子来源的circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)：位于细胞核，由内含子自身环化形成。此外，一些特殊类型的RNA也呈环状结构。例如，一些病毒(如丁型肝炎病毒)的环状基因组间 RNA；在古生菌及藻类中发现的tRNA或rRNA加工的中间产物及部分具有管家基因功能的RNA分子(如核酶 RNase P 和 snoRNA)［8］。

不同类型的circRNA剪接方式存在明显区别。目前推测ecircRNA和EIcircRNA可能由3种机制产生［5-9］。①套索驱动环化：又称外显子跳跃，由3′端剪切供体与 5′端剪切受体结合，通过内含子跳读产生包含外显子的套索，内部拼接后去除内含子，形成ecircRNA。②内含子配对驱动环化：又称直接反向剪接，通过两侧内含子碱基配对诱导环化，pre-mRNA经剪切拼接后可形成ecircRNA或EIcircRNA。③RNA结合蛋白 (RNA binding protein，RBP)介导的环化：RBP结合到pre-mRNA内含子上鸟嘌呤及3′端富含胞嘧啶区域，进而使套索RNA免遭分支酶的降解。ciRNA合成机制主要依赖于5′剪切位点附近的7nt GU序列和3′分支位点的11 nt C序列共有基序，以 2′，5′-磷酸二酯键使首尾相连［7］。 此外，尚不排除其他机制参与circRNA合成。

二、circRNA的表达特点

circRNA在各种生物中均广泛表达，具有以下5种基本特征。①丰度高：超过10%的基因可转录产生circRNA。虽然大多数circRNA在细胞内呈低表达，但研究发现部分circRNA表达量可达到相应线性mRNA的20倍［4,6-10］。②高度保守性：对比分析果蝇、小鼠及人类脑内的circRNA发现，大部分circRNA序列在进化过程中呈现较高的保守性［10］。③稳定性：由于circRNA无游离的3′ploy(A)末端，因此能抵抗 RNA核酸外切酶和脱支酶的降解，较mRNA更稳定［9］。④组织特异性：部分circRNA表达呈现明显的组织特异性。如ciRS-7是一种脑组织特异性表达的circRNA，在其他组织中几乎不表达［11］。⑤疾病相关性：目前已在多种疾病中发现相关 circRNA 存在差异性表达［12］。

三、circRNA的生物学功能

circRNA的生物学功能复杂多样，主要表现在4方面。

(一)充当miRNA海绵

微小 RNA(microRNA，miRNA)是一类长度 18～25 nt的单链非编码RNA，调节相应靶基因mRNA表达，广泛地参与各种生理及疾病发生、发展过程。所谓“miRNA海绵”指circRNA依赖自身miRNA结合位点吸附特定miRNA，充当竞争性内源RNA，抑制miRNA与靶基因结合。2013年，Hansen 等［13-14］率先证实 ciRS-7/CDR1as 与 miRNA-7 的相互作用模型。ciRS-7/CDR1as是一种由Cdr1基因反义链转录产生的ecircRNA，具有73个miR-7的结合位点，而miR-7密切参与调节中脑发育。研究发现，将外源性ciRS-7/CDR1as导入斑马鱼胚胎中，产生与miR-7敲除相似的表现，即中脑发育体积明显减小，而注入miR-7前体则使中脑损伤程度减轻［15］。因此，认为ciRS-7/CDR1as通过有效地吸附miR-7而使其功能受抑制。最近，Piwecka 等［11］利用 CRISPR/Cas9 技术将小鼠的CDR1as基因敲除，发现miR-7表达水平明显降低，而miR-671的表达水平却显著升高。该研究认为，miR-671比miR-7更稳定地结合于CDR1as，使CDR1as失去对miR-7的吸附作用，导致miR-7表达水平升高。circRNA-miRNA-mRNA调节通路是目前揭示circRNA生物功能的研究热点。值得注意的是，由于miRNA的长度较短，circRNA可有多个miRNA结合位点，然而这些位点能否吸附miRNA并产生相应的生物学作用，仍需进一步证实。

(二)调节基因转录

ciRNA与EIcircRNA均含有内含子，在细胞核内调节基因转录。一方面，其可作为反式调节因子参与基因转录后调节，如高表达circRNA sirt-7与聚合酶Ⅱ复合体相互作用，调节亲本基因的表达。另一方面，ciRNA(如ci-ankrd52)和EIcircRNA(如circPAIP2)分子也可通过与U1 snRNP作用，形成RNA-RNA复合物，在启动子区结合RNA聚合酶Ⅱ转录复合体，对母系基因发挥顺式调控作用［7］。

(三)circRNA与蛋白质相互作用

circRNA也有吸附蛋白质功能。如Cis-7/CDR1as和SRY circRNA结合miRNA效应因子AGO蛋白，使其降解。Circ-Foxo3与细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21结合后，抑制CDK2的活性，将细胞阻滞在G1/S期，抑制细胞增殖［16］。 Ashwal-Fluss 等［17］证实，由剪接因子 MBL/MBNL1 基因第2个外显子形成circMBL的侧翼内含子中有许多盲肌蛋白(muscle blind，MBL)结合位点，MBL与circMBL的合成密切相关。当MBL蛋白表达量增加时，可促进circMBL生成，降低MBL的mRNA水平；而生成的circMBL又可与多余的MBL结合将其消除，从而使MBL蛋白表达水平保持动态平衡。

(四)参与蛋白质合成

一些circRNA可被翻译为生物功能性蛋白。如丁型肝炎病毒的circRNA在哺乳动物细胞中可编码产生致病性病毒蛋白［18］。另外，将内核糖体进入序列插入至人工合成circRNA，能使其以滚环扩增形式翻译成多肽或蛋白质［19-20］。最近，Legnini等［21］发现 circ-ZNF609 以不依赖于 5′端帽子的方式，产生肌细胞分化调节蛋白。我国学者还证实在恶性胶质瘤中，circ-FBXW-7可翻译一种抑制胶质瘤的FBXW7-185aa蛋白。通过协同母基因编码的FBXW7蛋白调控原癌基因c-Myc蛋白的稳定性，抑制恶性胶质瘤的发生、发展［22］。由此可见，circRNA并非均属于非编码RNA。其蛋白质编码功能也需进一步探究。

circ RNA调控结肠直肠癌的发生和发展

过去30余年证实大量非编码RNA参与结肠直肠癌(colorectal cancer，CRC)多步骤、多阶段的发生、发展。circRNA作为新成员，其地位日益显现［23］。多项研究证实，CRC病人的circRNA表达谱与健康人群存在显著差别［24-27］。2015年，Bachmayr-Heyda 等［24］通过 RNA-seq 技术发现，癌组织中circRNA丰度较癌旁组织显著降低。体外实验发现，circRNA表达水平与CRC细胞增殖速率及疾病进展水平呈负相关。Zhu等［27］利用包含2 608个人类circRNA分子芯片，检测3对癌与癌旁组织表达水平。研究发现癌组织中有136个分子表达水平明显上调，243个分子表达下调。迄今，多种CRC相关的circRNA被鉴别并初步阐明致病机制，具体表现在3个方面。

一、miRNA海绵作用

E3泛素蛋白连接酶(ITCH)可靶向作用于Dvl2，进而调控Wnt/β-catenin信号通路。cir-ITCH是一种由ITCH外显子产生的 circRNA。 Huang等［28］发现，在 CRC 组织中 cir-ITCH 表达水平显著降低。cir-ITCH通过竞争性吸附miR-7和miR-20a，使ITCH表达水平明显升高，进而促使磷酸化DVL2泛素化及分解，抑制Wnt/β-catenin信号通路。此外，cir-ITCH还能引起增殖相关癌基因(c-myc和cyclinD1)表达水平显著下降，抑制CRC细胞的增殖。因此cir-ITCH是一种“抑癌circRNA”。研究发现，ciRS-7不仅与神经功能发育密切相关，而且在神经母细胞瘤、星形细胞瘤、肾细胞癌及肺癌中均有广泛表达，参与多种肿瘤相关的调节信号通路［13］。最近Weng等［26］研究发现，CRC病人癌组织中ciRS-7表达水平比癌旁组织中升高2.4倍。在包含318例CRC两组队列中，证实ciRS-7高表达与肿瘤分期、淋巴结浸润、远处转移及病人预后密切相关，可作为CRC的独立预后标志物。风险比(hazard ratio，HR)分别为2.07和2.69。进一步通过体内、体外实验证实，ciRS-7竞争性地结合miR-7，并削弱其对EGFR/RAF1/MAPK信号通路的抑制作用。该研究还表明，ciRS-7可作为CRC潜在的生物治疗靶点。

上述研究揭示，miRNA能结合不同circRNA，激活或抑制不同的信号通路，产生多种生物学效应。提示两者并非是单一的线性调控模式。最近，Hsiao等［25］研究阐明circRNA与miRNA的网状调节机制。首先通过RNA-Seq技术，发现circCCDC66在肠道肿瘤组织中表达水平明显升高。临床病理资料分析发现，circCCDC66高表达病人预后往往较差。此外，circCCDC66区分CRC病人与健康人的受试者工作特征曲线下面积 (area under receiver operating curve，AUC)为0.884 3，是一种较好的诊断标志物。因此，circCCDC66具有广阔的临床应用前景。然后通过体外实验发现，circCCDC66促进CRC细胞的增殖、迁徙及转移。为证明circCCDC66吸附多种miRNA，并调节下游靶基因表达，利用生物信息学技术选取多个CRC致病基因 (包括DNMT3B、EZH2、MYC和YAP1)作为研究对象，这些基因均受circCCDC66吸附miRNA的调节。circCCDC66过表达后，上述基因表达水平明显升高。敲除circCCDC66则反之。通过外源性导入生物素化circCCDC66后，发现circCCDC66吸附分子miR-33b、miR-93表达水平明显降低；而circCCDC66基因敲除后引起miR-33b和miR-93的释放。最后，小鼠成瘤实验证明circCCDC66与CRC的肝转移密切相关。该研究证实circCCDC66作为一种癌基因circRNA，保护多种癌基因逃逸抑癌miRNA的降解，进而促进肿瘤形成。

目前认为circRNA在转录后水平影响miRNA的表达。Zhang等［29］通过定量 PCR发现，在 CRC组织中 hsa_circ_0020397与miR-138表达水平呈明显负相关。荧光素酶报告实验证实，hsa_circ_0020397与miR-138相互结合。进一步检测miR-138靶基因TERT和PD-L1表达水平后发现，hsa_circ_0020397过表达使TERT和PD-L1表达水平明显升高，提示miR-138的抑癌作用遭弱化。反之，利用siRNA抑制TERT和PD-L1表达后发现，hsa_circ_0020397生物功能减弱。因此，尽管hsa_circ_0020397不影响miR-138表达水平，但仍可促进miR-138靶基因表达。

二、circRNA与基因突变

circRNA在疾病不同阶段呈现时序性表达特征。KRAS基因突变是CRC发生、发展过程中的一个重要分子事件。Dou等［30］研究发现，KRAS突变明显改变细胞 circRNA表达谱，使circRNA丰度显著降低。其研究结果显示，与KRAS等位基因野生型细胞系相比，DLD-1(G13D野生型和KRAS等位基因突变)和DKO-1(KRAS等位基因突变)细胞系中circRNA整体表达水平明显降低。该变化在CRC细胞系HCT116(KRAS突变)和HKe3(KRAS野生型)得到进一步验证，表示对疾病的精准化诊疗具有重要意义。

三、circRNA与外泌体

外泌体是细胞分泌的膜性囊泡，包含蛋白质、脂质及核酸等多种成分，可参与调控各项生命活动。Dou等［30］发现细胞以微囊泡的形式分泌circRNA，且外泌体中circRNA含量甚至高于细胞。Busson等［31］也证实细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)中检测出circRNA，并推测细胞通过EV转运circRNA，完成细胞间信息交流。 Li等［32］发现，CRC 病人血液中circKLDHC10的表达水平明显高于健康人，有望成为诊断肿瘤的新型标志物。

展 望

circRNA是一种丰度高、结构稳定的非编码RNA，常作为转录后调节因子，参与多种疾病的发生、发展。随着研究的进展，对其生物学功能认识不断地拓展。近来研究表明，circRNA对完善CRC诊疗具有重要的临床意义。一方面，circRNA作为一种新型的生物学标志物，指导CRC病人的早期诊断、疾病监测及预后评估。另一方面，随着miRNA靶向药物研究的进展，小分子核酸药物成为研究热门领域。阐明circRNA对miRNA调控的机制，对进一步明确miRNA作用机制以及未来circRNA靶向药物研发具有重要意义。然而，由于circRNA研究尚处于起步阶段，目前仍存在以下不足。①对circRNA的具体合成机制缺乏了解。②circRNA在CRC发生、发展过程中的调节作用仅限于circRNA-miRNA调节轴。③尚无circRNA标准化检测及分析平台，不利于比较各研究机构间的结果［33］。随着更多研究成果的累积，circRNA研究领域的未解之谜终将被解开。