加味甘麦大枣汤对慢性应激抑郁模型小鼠行为的影响

闫一民 张 璐 戴佳婕 肖 枫 唐顺儿 罗宇龄 刘烜彬 伍璟瑜常 乐 赖文静 苗婉菁 陈盛强 钟 成

1 广州医科大学(广州511436)2 广州医科大学附属第二医院 (广州 510260)

抑郁症(depression)是情感性精神障碍(mood-disorders)的主要类型,主要特征是显著而持久的心境低落。随着社会发展、生活节奏加快,社会环境及心理因素等各种应激因素的增加，抑郁症发病率逐年攀升，已成为现代社会的常见病、高发病。现代药理学研究表明,抑郁症的病因甚为复杂,诱发原因诸多,目前的抗抑郁药主要基于脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)等研发而成。但西药具有成本高、价格贵、副作用大等缺点，甚至部分患者服用后产生锥体外系反应，而部分有药物不良反应。而中药的治疗效果逐渐被人们所发现，中医中虽并无“抑郁症”此病名,但郁证、失眠、脏躁症状与其相似,故全部归于本病范畴。中医理论认为, 抑郁症是以“悲 ”和“愁”为突出的心境体验,其病理机制在于心气不足与肝气不舒两方面。根据中医辨证施治的原则, 临床上以疏肝理气解郁为主,辅以养心安神、补益心脾、滋补肝肾等治法。药物类型则多以理气、祛痰、安神、开窍、补益心脾等为主。目前国内外对抑郁症的治疗，方法各异，但如何真正有效且少副作用地缓解抑郁症患者的痛苦仍是当今医学界面临的一大难题。

甘麦大枣汤出自《金匱要略·妇妇人杂病脉证治》,由甘草三两,小麦一升,大求十枚配制而成,具有补益心脾,宁心安神之功效,主治由情志不舒或思虑过度,肝化火,耗损阴液,心神失养所致的的脏躁[1]。本方被现代中医广泛用于抑郁症的治疗。据统计,以甘麦大枣汤治疗抑郁症占所有抑郁症用方的比重为约14.84%,并取得了一定的疗效[2- 3]。本研究主要探讨慢性应激抑郁模型小鼠系统性应用加味甘麦大枣汤,在高架十字迷宫,旷场试验, Morris水迷宫中抑郁小鼠行为恢复水平与正常型水平的差距。本研究为抑郁的治疗提供了一种新的思路，为研发新的治疗抑郁的药物提供实验依据，并为今后的临床运用提供理论基础和实验方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材

①加味甘麦大枣汤(炙甘草,五味子,浮小麦15～30 g,大枣15～30 g,干地龙各6～10 g,僵蚕,党参,煅龙骨各15～20 g,珍珠末(冲)2～4支,蝉蜕,制天麻各8～12 g,白术8～15 g,钩藤10～15 g,茯神20～30 g,全蝎6～12 g)

②小鼠体质量称量仪

③行为学器材：高架十字迷宫，Open field test, Morris水迷宫系统

④苦味酸染色剂

1.2 动物

所有实验动物的操作及饲养均符合广东省及广州医科大学实验动物管理饲养条例，遵循动物伦理学原则。

由广州医科大学番禺校区动物中心提供小鼠14只，小鼠采用四周育龄，体质量在12～18 g的。适应饲养一周后，取小鼠随机分用药组5只、模型组5只及空白组4只雌雄单笼饲养，并采用苦味酸进行染色标记。

1.3 建造抑郁小鼠模型

①造模前记录小鼠体质量。

②造模：将用药组和模型组放入小鼠电击箱，调节电压至30 V。重复给予小鼠连续的不可预测和不可逃避的足底电击[4]。总电击时长 30min。空白组不作任何电击处理。

③每天电击结束时，给予用药组小鼠200 mL配制加味甘麦大枣汤代替饮用水，给予模型组和空白组等量生理盐水，每天更换水和药剂，持续到造模完成。

④第13天结束造模后记录小鼠体质量。

1.4 行为学实验

造模7天后，第8天进行高架十字迷宫实验及旷场试验，第9天进行水迷宫实验，持续实验6天，并记录数据。

1.4.1 旷场：实验由一个不透明敞箱组成，将占箱子底面九分之一的正方形区域作为中央区域，敞箱底部其他部分作为外周区。敞箱上方有摄像头记录小鼠的活动。将小鼠放置中央区域后，迅速撤开，观察小鼠的活动并进行记录。分别记录中央区和外周区的活动时间和活动路程并记录小鼠在中央和外周区停留的次数。每只小鼠的实验时间为5min，每完成一次实验之后要清理粪便等残留物，并用酒精和纱布擦拭敞箱，以免动物的残留气味对下一次实验造成影响。实验在安静和光线不变的条件下进行。实验前，动物在测定房间中适应 10min 以上[5- 6]。

1.4.2 高架十字迷宫：高架十字迷宫主要通过利用动物对新异环境的探究特性及其对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。实验在统一条件的光线和环境下建立一个十字型高架，设置两个方向的开臂和两个方向的闭臂区，开臂区三面没有遮挡，只有底部的高架；闭臂区除了顶部以外均用挡板进行遮挡。将四臂交汇的中心区设置为起点，将小鼠放在中心区，观察小鼠进入开放臂和封闭壁的潜伏期、次数以及在两壁滞留时间(进出臂标准应严格界定，以四肢全部入臂或两只前爪出壁为准)，计算小鼠进入开臂次数和在开臂滞留时间分别占总次数(进入开臂和闭臂次数之和)和总时间(在开臂与闭臂滞留时间之和)的百分比，并用摄像头记录小鼠的活动轨迹。每只小鼠进行一次实验，实验进行5min，每次实验后用酒精清洗实验装置以免气味干扰[7]。

1.4.3 Morris水迷宫：通过非常多的应用,水迷官实验在当代神经科学研究中占据了一个十分重要的位置[8]。本实验涉及的水迷宫为 Morris水迷宫( Morris water maze,MWM)。在水迷宫实验中,让动物利用远侧暗示从起始位置游到水下隐匿平台,用重复训练来评估空间学习,当水下平台被撤出时,用平台象限偏爱来确定动物的参考记忆[9]。

将一个圆形不锈钢水池装水并假定等分为四个象限，目标象限中放置一个圆形隐形平台；让水池中水面高于平台0.5 cm，水温保持21℃～22℃；实验期间保持水迷宫内外环境和光线始终不变，并且水迷宫周围需要有一定的参照物让小鼠进行记忆和学习，水迷宫上方有一个摄像头自动记录小鼠的活动行为。将小鼠从平台所在象限的对角象限入水点放下，运用Smart软件记录小鼠规定2min时间内从入水点到找到爬上平台(逃避潜伏期)的时间和路程。实验进行1～4d的训练学习,在此期间小鼠每天训练两个阶段,每个训练阶段包括四次试验。分别使小鼠随机地从东西南北四个方向象限开始,每转变一次方向让小鼠休息10～15min。把小鼠从水池中移出之前必须让小鼠在平台上休息15s中。对于那些在120s内还没有找到平台的小鼠,试验者要把小鼠放在平台上,并且让其在平台上休息15s。然后再把它从水池中移出。两个训练阶段之间要间隔90min，4～7d进行实验，记录小鼠的活动时间和活动路程，并记录下小鼠活动的轨迹。[10- 13]

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 旷场结果

通过数据分析我们发现三个组在中央区活动距离、中央区活动速度、中央区活动时间、周围区活动时间指标上并无差异，但是在周围区活动距离、周围区活动平均速度方面空白组和模型组、用药组存在差异(见表1)。在平均值的对比下，空白组在中心区和周围区的活动速度都高于另外两个组，空白组的外围区的活动时间和活动距离也是三组中最高。模型组在中央区的活动距离和中央区的活动时间都在三组中最高，说明模型组更多停留在初始周围位置，缺乏探索性，情绪比较低落。

2.2 高架十字迷宫结果

通过数据分析，虽然我们发现在开闭臂的次数、路程、时间和相应的比值的单因素方差分析中并未发现差异(见表2)，但通过平均值数据的比较，我们发现空白组小鼠进入闭臂的次数和路程高于模型组和用药组，同时空白组小鼠在开臂的停留时间三组中最长，而模型组的小鼠四脚进入开臂的次数最少，在闭臂的停留时间在三组中最长，活动范围减少。用药组小鼠四脚进入开臂的次数在三组中最高。

中央区活动距离/cm 中央区活动平均速度(cm/s)中央区活动时间/s周围区活动距离/cm周围区活动平均速度(cm/s)周围区活动时间/s模型组1 925.60±713.4150.32±9.0239.96±16.996 332.08±969.8924.47±3.99259.76±16.85用药组1 675.32±680.0750.13±8.9933.24±12.066 249.02±653.6023.52±3.09266.44±11.99空白组1 763.12±502.9857.23±17.8832.17±11.238 005.85±439.8929.99±2.13267.32±10.92 F0.1900.4800.4397.6554.9780.432P0.8290.6310.6560.0080.0290.660

进入闭臂次数/次闭臂滞留时间/s闭臂路程/cm模型组15.60±8.20168.62±52.722 253.03±508.18用药组18.40±3.04165.0±48.032 644.30±184.52空白组19.25±4.71140.67±58.212 932.52±667.28F0.5020.3582.309P0.6180.7070.145

2.3 Morris水迷宫结果

通过分析数据我们发现：在定位航行实验中速度的指标上，用药组和空白组有差异(P=0.030)(见表3)；在原象限游泳时间与游泳总时间之比的指标上，用药组、模型组和空白组之间不存在差异；在原象限游泳的距离与游泳总距离之比的指标上在单因素方差分析的事后多重比较上，模型组和用药组依然存在差异。用药组小鼠在第六天时，原象限游泳的距离与游泳总距离之比的平均值、在原象限游泳的时间与游泳总时间之比的平均值都较模型组较高。空白组小鼠较之模型组小鼠的原象限游泳的距离与游泳总距离之比的平均值、在原象限游泳的时间与游泳总时间之比的平均值也都较高。原象限游泳的距离与游泳总距离之比越大说明该组小鼠在原平台所在象限游过的距离也就越长。原象限游泳的时间与游泳总时间之比越大也表明该组小鼠在原平台所在象限花费的时间越多。

表3水迷宫第六天定位航行实验测定指标值

3 讨 论

从行为学表现来看，用药组小鼠基本能力恢复到了正常水平，在旷场实验中用药组小鼠各指标水平则处在两组之间，说明加味甘麦大枣汤一定程度上恢复了小鼠的自主探索能力和活跃程度。同时经过电击等措施的小鼠出现明显的抑郁表现，中央区活动速度减慢，周围区活动距离减少，反映模型组和用药组小鼠面对陌生环境的自主探索性和活跃程度减少，出现抑郁症状，说明抑郁小鼠模型构建成功。

高架十字迷宫试验是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。小鼠由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。在高架十字迷宫试验中我们发现空白组小鼠进入闭臂的次数和路程高于模型组和用药组，说明高空的开臂使小鼠发生了恐惧心理，同时空白组小鼠在开臂的停留时间三组中最长，说明三组中空白组的探索能力相对更高。而模型组的小鼠四脚进入开臂的次数最少，在闭臂的停留时间在三组中最长，说明模型组小鼠存在明显抑郁，情绪低落的行为表现，缺乏对新奇刺激的探索性，活动范围减少。用药组小鼠四脚进入开臂的次数在三组中最高说明加味甘麦大枣汤缓解了抑郁小鼠的焦虑症状的行为表现，出现更多的探索性行为，进入开臂的次数增多，焦虑抑郁情绪也得到了缓解，严重程度降低。

水迷宫实验主要是通过强迫小鼠游泳，使其寻找隐藏在水中的休息平台，从而训练小鼠进行空间定位和记忆，观察小鼠的空间定位和学习记忆能力。在水迷宫实验中用药组和空白组的时间之比，距离之比都较之模型组高。说明用药组和空白组学习记忆和空间定位表现更好，原象限游泳的距离与游泳总距离之比越大说明该组小鼠在原平台所在象限游过的距离也就越长。原象限游泳的时间与游泳总时间之比越大也表明该组小鼠在原平台所在象限花费的时间越多，在该象限的空间定位和探索更频繁。综上可知，加味甘麦大枣汤对小鼠抑郁症的缓解起到了一定的作用，较有效的改善了抑郁的小鼠的空间定位和学习记忆能力，使其基本能力恢复与正常小鼠水平相当。

总的来说，模型小鼠的自主活动量减少、高空探索性能降低，同时学习记忆水平提高缓慢，抑郁情绪明显，说明造模成功；没有接受过任何刺激的空白组活动水平及学习能力接近野生小鼠水平；接受药物治疗的用药组，自主活动量、高空探索性能以及学习记忆水平总体上介于模型组和用药组之间。最后通过对比，用药组活动几乎接近正常水平，表明用药组在口服加味甘麦大枣汤以后，确实缓解和改善了小鼠抑郁情绪，进而影响其行为水平。

但是我们的实验仍存在继续研究的可能比如药物剂量大小及实验观察期长短，或者需要更长时间的用药观察期及大样本观察。抑郁症疾患增长的现状促使科学研究需要不断前进，而要想取得更大的进步，需要不断尝试创新，从中药入手也不失为寻找新方法的重要手段，加味甘麦大枣汤已经在临床上用于治疗抑郁症，而我们实验表明它同样对抑郁小鼠的症状改善有一定的作用，为临床上的使用提供了一定的实验依据。虽然实验有待进一步深入探究，但是目前基于小样本量，能观测到部分向上的趋势，未来继续深入研究探讨，离探明加味甘麦大枣汤对改善抑郁的作用机制将会越来越近。