姜黄素抑制牙本质胶原降解的初步研究

张 颖 王洪涛 张云燕

广州市妇女儿童医疗中心口腔科(广州 510623)

龋病是人类的常见病、多发病。通常当患者因牙齿龋坏造成不适就诊时，病损程度多已达牙本质，形成牙本质龋，患者可能会出现牙本质敏感、咬合关系紊乱、牙髓暴露甚至更严重的牙齿折断等，明显降低患者的生活质量。牙本质是牙齿的主体，主要由有机质和无机质组成。在牙本质的有机成分中，约90%为胶原。牙本质龋的进展主要包括硬组织脱矿和有机质的溶解，有机质的溶解促进牙本质的脱矿。有机质的溶解与牙本质中含有胶原蛋白酶相关。正常牙本质基质中存在潜在形式的前胶原蛋白酶，在龋损牙本质中，细菌及其代谢产物等刺激胶原蛋白酶显示较高的活性，直接破坏牙本质胶原，并加速牙本质脱矿，进而加快牙本质龋病的进程[1]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是牙本质有机质中含量最多的胶原蛋白酶之一，是降解牙本质有机质的主要蛋白水解酶。迄今为止在人类机体内发现二十多种，而其中MMP2最早被证明存在于矿化的牙本质中，是牙本质中含量最多的MMPs，其次为MMP9[2]。因此提示降低MMPs活性是抑制牙本质龋进展的方法之一。多项研究显示姜黄素可以抑制肿瘤组织中MMP2、9的活性[3- 4]，但姜黄素对牙本质中I型胶原的作用尚未见相关研究。本课题初步探讨姜黄素对牙本质龋进展过程中胶原降解程度的影响，为阻止牙本质进一步龋坏提供新的思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 牙本质龋模型的建立

1.2 标本的处理

取出脱矿的牙本质块，4℃下去离子水搅拌冲洗72 h，彻底去除牙块表面的脱矿液。然后将样本随机为五组：① 10 mmol/LDMSO组；② 2 mmol/L APMA(MPPs激活剂，胶原酶潜酶活化剂)组；③ 2 mmol/L EDTA(MPPs抑制剂)组；④ 姜黄素溶液(姜黄素取3 μmol/L、9 μmol/L、12 μmol/L三种浓度)组。将牙本质龋标本置于上述各组溶液中24 h，3 d，7 d，14 d，离心后吸取 100 μL的上清液使用Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(Cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP)ELISA试剂盒(武汉纯度生物, 中国)检测ICPT的表达水平。

1.3 统计学处理

将不同组间ICPT的浓度使用SPSS 13．0软件进行方差分析，组间比较用q检验，显著性标准α=0.05。

2 结 果

2.1 成功构建牙本质模型

经过脱矿液处理后牙本质呈瓷白色，表面粗糙，电镜下见牙本质小口完全开放，牙本质小管口完全暴露，管口直径约3 μm，牙本质小管排列整齐；未经脱矿液处理的牙本质呈淡黄色，表面光滑，电镜下观察，见牙本质小管内大量的组织残渣，甚至堵塞牙本质小管，见图1。

A.经脱矿液处理后牙本质表面形态B.未经脱矿液处理的牙本质表面形态图1 牙本质经脱矿后表面形态(×2000)A.经脱矿液处理后见牙本质小管排列整齐,管内清洁,无残渣; B.未经脱矿液处理的牙本质小管内大量的组织残渣,甚至堵塞牙本质小管

2.2 ICPT的检测结果

浸泡溶液的成分和浸泡时间对ICTP的含量均有影响，见图2。与APMA相比，牙本质龋模型经12 μmol/L的姜黄素处理24 h后，ICTP的浓度降至(0.49±0.04)ng/mL，(F=8.459，P<0.05)，而且随着处理时间的延长，ICTP的浓度未见明显升高。牙本质龋模型经APMA处理后ICTP浓度升高，且随着浸泡时间的延长，ICTP浓度逐渐增加。与APMA相比，EDTA组ICTP的浓度在24 h后降低，仍高于姜黄素组(F=157.151，P<0.05)。说明姜黄素组能快速、有效地降低ICTP的表达水平。

图2 ICPT的检测结果

3 讨 论

牙本质是牙齿的主体，其化学组成主要是矿物质，占其重量的70%，有机物和水占30%。在牙本质有机成分中，约90%为胶原，以I型胶原含量最多，约占80%。

I型胶原聚集形成直径约70～90 nm的主纤维，并与直径约20～40 nm的非胶原蛋白组成的次级分支纤维相连接，构成胶原纤维网，其结构的完整性表现为结构中存在典型67 nm条带[5]。

正常牙本质基质中存在潜在形式的前胶原酶，MMPs是牙本质有机质中含量最多的胶原蛋白酶之一。MMPs为内肽酶，均以潜酶形式分泌，激活后能从肽链中间裂解底物，MMPs活性能为相应的特异性抑制因子所抑制。MMPs是一组锌依赖性蛋白酶，在中性条件下可以发挥降解细胞外基质的作用，有钙参与时活性最大，MMPs以无活性的前提形式存在，只用在活化后才能降解细胞外基质[6]。

在龋损牙本质中，MMPs显示较高的活性，可破坏牙本质胶原，并加速牙本质脱矿[7]。研究显示牙本质中的MMPS以MMP2、MMP9为主，在牙冠部及根部均有分布。在龋坏牙本质中MMP2，MMP9的活性增加。此外，牙本质细胞分泌的MMP2，MMP9明显增加，加速牙本质龋病的进程。在治疗龋病过程中，由于高速手机的刺激及口内环境中水、酶等各种因素的影响，暴露的胶原纤维在牙本质内固有的MMPs等的作用下发生降解，使混合层的有机成分损耗，导致粘结破坏[8]；牙本质中树脂粘结单体扩散梯度降低，出现了沿着混合层底部的不完全渗透区域，部分胶原纤维暴露，MMPs被激活，而未被粘结树脂包裹的胶原纤维会缓慢降解，同样会影响树脂粘结界面的退行性变，导致充填物脱落，治疗失败[9]。因此抑制牙本质中MMPs的活性，减少I型胶原的降解是龋病治疗的关键点之一。

目前临床上主要有两类MMPs活性抑制剂，分别为局部用药和全身用药。局部用药将药物直接涂布于患牙处，局部药物浓度高，抑制MMPs活性的作用显著，局部常用的抑制MMPs活性制剂主要有EDTA和0.2%醋酸氯己定等。EDTA尽管具有抑制MMPs活性的作用，但其化学成分促进牙本质脱矿，副作用较大。0.2%醋酸氯己定体外用于抑制牙本质MMPs的浓度大于常用的黏膜消毒浓度(0.05%)，外用刺激性大[10]。常用的全身用药抑制MMPs活性的药物如巴马司他、马立马司他、MMI- 270等，常用于肿瘤患者，因毒性大、副作用多、外用性质不稳定、价格较贵等缺点[11]，限制其在牙本质龋中的应用。因此寻找一种安全、经济、有效的抑制MMPs活性的药物，对龋病的防治显得尤为重要。

姜黄素是从亚热带地区多年生草本植物姜黄根茎中提取的一种植物多酚，是姜黄中最重要的活性成分，姜黄素的化学结构对称，含有2个酚羟基、2个甲氧基、2个不饱和羰基和1个活泼的亚甲基，这些基团都是与生物大分子结合的潜在位点。同时，姜黄素毒性低，口服吸收少，生物利用度低，可溶于多种溶剂，在低pH值环境中性质仍然稳定[12]。这提示姜黄素是一种理想的外用剂型。多项研究显示姜黄素具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多方面药理作用[13]。在肿瘤组织中姜黄素具有抑制MMP2、MMP9的活性，从而抑制肿瘤的转移等多种作用[14]。在牙本质龋中，本实验证实姜黄素降低I型胶原降解，在预实验中发现姜黄素的浓度大于12 μmol/L时对细胞具有明显的毒性。因此本研究中姜黄素的最高浓度选择 12 μmol/L，当姜黄素的浓度小于12 μmol/L时，随着姜黄素浓度的增加牙本质胶原降解的量明显减少。鉴于姜黄素抑制胶原降解，并可以抑制变形链球菌生物膜形成的作用[15]，姜黄素具有开发成为阻止牙本质龋进一步进展的天然药物的潜能。

将来，我们将进一步挖掘姜黄素的药理作用，开发姜黄素制剂用于治疗和预防牙本质龋。同时，进一步研究姜黄素抑制牙本质胶原分解的机制。已有研究表明在不同的肿瘤中姜黄素作用于MMPs的分子机制不同。在口腔鳞状细胞癌中姜黄素通过p53-E-Cadherin表达，抑制MMP2、MMP9活性，抑制肿瘤细胞转移[16]。在乳腺癌的模型中，姜黄素通过抑制IκBα激酶活性，抑制IκBα磷酸化和降解，从而通过抑制NF-κB通路，降低MMP2、MMP9的表达和活性[17]。姜黄素加入肝癌细胞培养液中，抑制AKT 和STAT3磷酸化，抑制MMP9活性，从而抑制血管生成[18]。在牙体硬组织中姜黄素作用的具体分子机制不明，我们将进一步深入研究，丰富姜黄素的作用机理。