泗阳县水产养殖常见致病性菌对药物感受性特点以及结果分析

李晓丽，冯龙，陈瑜，李勇

（泗阳县水产技术指导站，江苏 泗阳 223700）

近年来，泗阳县水产养殖业发展迅速，但每年细菌性病害对我县水产养殖都会造成一定的损失，给广大养殖户带来了一定的经济损失，甚至极少数养殖户养殖全军覆没，损失惨重，严重打击了养殖户的积极性。对病原菌的分离、鉴定和药物敏感性实验可有效的防止药物的滥用和误用。

为了指导辖区各渔场防控细菌性病害并科学选择和实验水产药物，2018年4月至11月，泗阳县水生动物疫病防控中心对县域内水产主要养殖品种进行了疫病监测，并对其感染致病性菌株进行了形态、生理生化特征、药物敏感性试验等研究，以期为泗阳县水产养殖细菌性疾病的病原和防控提供科学数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

来自泗阳县卢集镇、穿城镇、三庄乡、史集街道办、城厢街道办、爱园镇等渔场的多个发病养殖塘口，采集活力差、表皮充血、黑头、溜边等濒临死亡的水产样品。

营养肉汤、营养琼脂、TCBS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京路桥。氧化酶试剂盒购于杭州某公司，肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）（英文名API 20E）购于上海某公司，动物用药敏分析试剂板购于南京某医疗科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离纯化 样品先用酒精棉擦拭，用灭菌的镊子和剪刀取适量病变组织、内脏、血液、鳃等放于营养汤，置于28℃恒温培养箱中培养18～24 h。在无菌条件下，用灭菌的接种环取培养液划线接种于普通营养琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养18～24 h。观察菌落形态，并挑取可疑单个菌落划线接种在TCBS培养基和脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基上，分别置于37℃和28℃恒温培养18～24 h。

1.2.2 API试剂条微生物鉴定 用灭菌吸管挑取单个菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，将5 mL无菌水放进培养盒里，将试剂条放进培养盒内，将菌液接种到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用矿物油覆盖制定的生化孔（有划线的孔）ADH、ODC、H2S和URE。盖上培养盒，于35～37℃孵育18～24h，同时做氧化酶试验构成第21个试验。孵育后根据判读表判断个反应结果，参照生化谱手册，得到鉴定结果，同时参照NCCLs和CLSI标准对药物的敏感性及耐药性进行判断。

1.2.3 病原菌的药敏试验 该试验分别对30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌进行了抗菌素感受性试验。试验步骤如下：挑取纯化后的单个菌落于5 mL生理盐水中，制成0.5麦氏单位浓度的菌悬液制成A管；取2支10 mL的无菌生理盐水，打开任意一瓶，以无菌的方式向阴性对照孔分别加入200 μL的无菌生理盐水；从A管中吸取200 μL菌悬液加入到打开的10 mL无菌生理盐水中制成B管。将B管所有菌液倒入到经灭菌的V形槽中，再将另一支10 mL无菌生理盐水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到所有微孔中（阴性对照除外）200 μL；将加样好的药敏分析试剂板放入28℃的恒温培养箱中培养24～28 h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，孔内液体浑浊为阳性（+），孔内液体澄清为阴性（-），最低药物浓度即药物的最小抑菌浓度（MIC）。

表1 病原微生物检测采样品种和数量汇总表

2 试验结果

2.1 具体的采样地点、品种和数量

2018年4—11月在全县的13个养殖场塘口抽检76个样品，其中河蟹31个，草鱼29个，鲫鱼11个，小龙虾5个。如表1所示。

2.2 病原菌的分离及形态特征观察

分离的出的细菌在基础培养基营养琼脂上为光滑、湿润、微凸、无色或淡黄色菌落，在大部分脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落周围出现明显的、透明的蛋白溶蛋白圈，在TCBS上成圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落。

2.3 API试剂条微生物鉴定结果

试验分离出60个细菌分离株，阳性检测率78.95%。分别确定嗜水气单胞菌45株，占阳性检出率的75%，副溶血弧菌3株，占阳性检出率的5%，气味沙雷细菌4株，占阳性检出率的6.67%，如表2所示。还有未在表中列出的草鱼中检测出的土生拉乌尔菌、紫色色杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌各1株，河蟹中检出的阪崎肠杆菌、创伤弧菌、枸橼酸杆菌、布式柠檬酸杆菌、霍式格里蒙菌各1株，16株未知菌株。

30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌对8种抗菌药物的感受性性测定结果分别如表3、表4和表5所示。

表2 常见的水产病原细菌阳性检测结果汇总表

3 讨论与分析

试验用30株致病性嗜水气单胞菌、3株副溶血弧菌和3株气味沙雷氏菌对8种抗菌药物进行敏感性测定，对水产选用抗生素具有一定的参考价值。试验数据分析，采样分离到的的病原菌对不同抗菌素药物表现出了不同度的感受性和耐药性。30株嗜水气单胞菌对硫酸新霉素最敏感，敏感菌株率为100%，其次对氟苯尼考、乳酸环丙沙星、恩诺沙星和强力霉素敏感菌株率分别为96.7%、93.3%、90%和83.3%。但对红霉素最不敏感，耐药菌株率达93.3%，其次是甲砜霉素，耐药菌株率达83.3%。因此，建议在该区域内对嗜水气单胞菌引发的疫病首选硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸环丙沙星、恩诺沙星和强力霉素。

表3 30株致病性嗜水气单胞菌对抗菌素感受性

表4 3株副溶血弧菌对抗菌素感受性

表5 3株气味沙雷氏菌对抗菌素感受性

3株副溶血弧菌均分离于河蟹肝胰腺中，说明副溶血弧菌主要感染河蟹，通过药物感受性结果来看，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸环丙沙星、盐酸土霉素和强力霉素都敏感，敏感率达100%。通过流行性病学调查分析，这与当地成蟹养殖过程中较少使用抗菌药物相关联，当地成蟹对大多数抗菌药物有较好的敏感性。而对甲砜霉素耐药菌株达100%，经过调查，这可能是由于当地十几家养蟹户曾从同一苗种场购买扣蟹，而该苗种场被调查出多次使用甲砜霉素全池泼洒漂苗有关。对红霉素的耐药菌株达66.7%，经调查，这些塘口都有次数不等地使用过含红霉素成分的蓝藻药杀蓝藻的经历，造成了菌株对红霉素产生耐药性。

在草鱼、龙虾和螃蟹中均分离出气味沙雷氏菌，该菌是一种广谱菌。药物感受性实验得出，该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、乳酸环丙沙星敏感菌株达100%，对红霉素不敏感，耐药性达100%，其次是甲砜霉素也不敏感，耐药菌株达66.7%。这可能与使用过含红霉素成分的蓝藻药杀蓝藻的经历有关。

综上所述，泗阳县水产养殖过程中使用抗生素的现象较少，对大多说抗生素药物均表现出较高的敏感性。