皮内针刺激足三里对STZ诱导的2型糖尿病大鼠损伤的影响

曹育，武峻艳，安玉兰

(山西中医药大学，太原 030024)

近年来，全球糖尿病患病人数不断增长，已经严重危害到人类的健康，据世界卫生组织的不完全统计，全球每年新增糖尿病患者数达700万人[1]。糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病占到了总发病人数的90%以上，现在研究较多的是2型糖尿病。2型糖尿病还会引发很多并发症，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变等。现代医学对2型糖尿病治疗尚无特别有效的方法[2-3]。有研究发现[4]，经过针刺治疗(电针、皮内针)后，大鼠的空腹血糖和胰岛素、胰岛素抵抗指数、细胞功能及血脂水平都得到了明显的改善，说明针刺治疗能在一定程度上降低血糖、改善胰岛素抵抗，保护胰岛功能，延缓病情进展，但是具体的机制尚不清楚。有研究[5]表明，针刺(电针、皮内针)疗法可以有效提高GLP-1水平，可能因此而改善胰岛β细胞功能障碍。基于以上研究，本实验首次探究皮内针刺激足三里对2型糖尿病大鼠的改善作用。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar雄性大鼠30只，体质量200 g左右，购于苏州大学实验动物中心，许可证号SCXK(苏)2017-05。

1.2 试剂及仪器

链脲佐菌素(streptozotocin， STZ)购自 Sigma公司；胰岛素测定试剂盒购自上海基免实业有限公司；丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)试剂盒、活性氧(reactive oxygen species， ROS)试剂盒购自碧云天生物有限公司。p22phox(1：1000)、NOX4(1：500)抗体购自美国Santa公司；β-actin抗体(1：1000)购自北京中杉金桥生物公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物有限公司；ECL化学发光液购自美国Santa公司；组织自动脱水机(型号 TS-12N)购于湖北孝感宏业医用器材有限公司；石蜡切片机(型号 RM2235)购于德国Leica公司；垂直电泳槽、转移电泳槽(型号 VE-186)购于美国天能有限公司；正置显微镜(型号 BX41)购于日本 Olympus公司；引物沈阳鼎国生物公司合成捷基合成。各引物序列见表1。

表1 各引物序列

1.3 造模[6]、分组及血糖测定

随机选取30只大鼠喂高糖高脂饲料，持续喂养4周，4周以后通过尾静脉注射STZ溶液(30 mg/kg)，造2型糖尿病大鼠模型。并于注射STZ 3 d后禁食不禁水12 h，测定大鼠空腹血糖，血糖值达11～33 mmol/L即为造模成功，将造模成功的大鼠随机分为B组、C组，每组10只，B组只固定，不针刺；C组将大鼠固定于鼠板上，使双后肢充分暴露，根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”找到双侧足三里穴，采用皮内针刺入约0.2 mm并留针30 min，每日干预1次，连续干预2周。A组为随机选取10只大鼠，喂普通饲料。皮内针干预2周后禁食12 h尾尖取血，采用罗氏血糖仪再次测定空腹血糖。

1.4 各组大鼠血清中MDA、SOD、ROS及胰岛素的测定

末次刺激以后，3组大鼠通过腹主动脉采血约5 mL，低温离心10 min取血清，采用相关试剂盒测定各组大鼠血清中MDA、SOD、ROS及胰岛素的含量。

1.5 HE染色法观察各组大鼠胰腺组织的损伤情况[6]

将各组胰腺组织放入已经配制好的 4%多聚甲醛固定液中，固定3 d。放入不同浓度的乙醇中进行脱水。脱水后浸到不同浓度的二甲苯溶液中进行透明。透明后在不同浓度的蜡溶物中进行浸蜡。再放到包埋盒中进行包埋。固定到切片机上进行 5 μm手动切片。切片后进行烤片脱蜡，HE染色。

1.6 ReaI time PCR法测定各组胰腺组织中p22phox、NOX2 mRNA水平[7]

采用总RNA提取试剂盒(RNA Isolation Kit)提取RNA，并采用核酸蛋白检测仪测定 RNA纯度和浓度，采用反转录试剂盒(RNA First- Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)进行PCR扩增。反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性 30 s，60℃反应40 s，72℃变性30 s，30个循环。实验结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。△△Ct计算公式：△△Ct=(Ct目的基因－Ct内参基因)实验组－(Ct目的基因－Ct内参基因)对照组。

1.7 Western bIot检测各组大鼠氧化相关蛋白表达情况[8]

每只大鼠取胰腺组织约200 mg，剪碎后加入RIPA裂解液，匀浆裂解蛋白，低温离心取上清液备用，BCA试剂盒进行蛋白定量。煮沸蛋白变性，配制10%凝胶进行电泳。转膜，封闭，一抗过夜。加入HRP标记的二抗室温孵育1 h。涂匀ECL化学发光曝光5 min，凝胶成像仪呈像。

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖、MDA、SOD、ROS及InsuIin水平比较

3组大鼠空腹血糖、MDA、SOD、ROS及 Insulin水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)。与A组相比，B组、C组空腹血糖及血清中MDA、ROS水平升高，而SOD及Insulin水平降低(P＜0.05)；与B组相比，C组空腹血糖及血清MDA、ROS水平降低，而SOD及Insulin水平升高(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠空腹血糖及血清中MDA、SOD、ROS、InsuIin水平比较 ()

表2 各组大鼠空腹血糖及血清中MDA、SOD、ROS、InsuIin水平比较 ()

注：与A组比较1)P＜0.05；与B组比较2)P＜0.05

组别 n 血糖(mmol/L) MDA(nmol/L) SOD(U/L) ROS(U/mL) Insulin(μg/L)A 组 10 7.11±2.94 2.69±1.17 24.89±4.54 27.42±6.24 1.34±0.45 B 组 10 19.55±0.901) 5.98±1.281) 11.12±3.761) 37.63±2.591) 0.69±0.231)C 组 10 10.21±1.231)2) 3.54±1.321)2) 18.65±4.651)2) 32.63±6.361)2) 0.98±0.261)2)

2.2 HE染色法观察各组大鼠胰腺组织的损伤情况

显微镜下观察结果可见，A组胰腺胰岛内细胞排列整齐，大小一致，分布均匀；B组胰岛内细胞分布稀疏，形状不规则，排列紊乱，可见空泡样变；C组胰岛内细胞结构明显改善。详见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织HE结果(HE,×400)

2.3 各组大鼠胰腺组织中的p22phox、NOX2 mRNA含量比较

各组胰腺组织p22phox、NOX2 mRNA含量比较差异有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组p22phox、NOX2 mRNA含量与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。C组p22phox、NOX2 mRNA水平明显低于B组(P＜0.05)。详见表3。

表3 各组胰腺组织中p22phox、NOX2 mRNA含量比较()

表3 各组胰腺组织中p22phox、NOX2 mRNA含量比较()

注：与A组比较1)P＜0.05；与B组比较2)P＜0.05

组别 n p22phox mRNA NOX2 mRNA A组 10 0.51±0.16 0.45±0.15 B组 10 1.14±0.171) 1.26±0.131)C组 10 0.79±0.181)2) 0.86±0.211)2)

2.4 各组胰腺组织p22phox、NOX2蛋白表达情况比较

结果表明，各组胰腺组织p22phox、NOX2蛋白比较差异有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组p22phox、NOX2蛋白含量与 A组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。C组p22phox、NOX2蛋白含量比B组明显减少(P＜0.05)。详见图2、表4。

图2 各组胰腺组织p22phox、NOX2蛋白表达情况

表4 各组胰腺组织中p22phox、NOX2蛋白含量比较 ()

表4 各组胰腺组织中p22phox、NOX2蛋白含量比较 ()

注：与A组比较1)P＜0.05；与B组比较2)P＜0.05

组别 n p22phox NOX2 A组 10 0.35±0.17 0.38±0.16 B组 10 1.21±0.131) 1.08±0.091)C组 10 0.76±0.211)2) 0.69±0.111)2)

3 讨论

2型糖尿病典型的症状是胰岛B细胞受到破坏，导致胰岛素分泌不足或产生了严重的胰岛素抵抗。胰岛素由胰岛B细胞分泌，是唯一能降低血糖的激素。有研究表明[5]，针刺、皮内针均能改善2型糖尿病大鼠损伤情况，并且皮内针的效果更好，作者推测可能与针刺深度、刺激量有关，其机制可能与腧穴局部组织分布不同以及激活的粗细神经纤维不同有关。本实验优先选择了皮内针进行实验。以高脂饲料联合STZ建立2型糖尿病大鼠，通过测定空腹血糖，发现皮内针刺激足三里会明显降低2型糖尿病大鼠的血糖水平。笔者采用HE染色法观察了糖尿病大鼠胰腺组织的变化情况，结果发现，皮内针刺激足三里对大鼠的胰腺组织有明显的改善作用，说明皮内针刺激足三里对糖尿病确实有改善作用，但是其作用机制有待考察。糖尿病的发病机制复杂，其具体机制仍不清楚[9-12]。近年来，糖尿病在中医学中被认为是气虚阴亏之症，中医多层次的治疗糖尿病也起到了明显的效果[13]。目前认为，氧化应激在糖尿病的发生发展过程中起重要作用。产生氧化应激的原因主要是糖尿病患者机体代谢紊乱，导致 ROS过度产生，抗氧化物如SOD产生减少，有害代谢物产生增多如MDA[14-15]。本实验就有关氧化应激的指标进行了检测，结果发现，皮内针刺激足三里会使大鼠血清中 ROS和MDA的含量减少，而SOD的产生增多，说明皮内针刺激足三里能够缓解糖尿病大鼠的氧化应激。

NADPH氧化酶系是ROS在应激状态下的主要来源，笔者推测NADPH氧化酶系也参与了氧化应激所以又进一步探究了影响氧化应激的因素。NADPH氧化酶系位于细胞膜上，是一类特殊的电子传递链复合物，由7个亚基构成，包括 NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5和DOX1/DOX2，其中 p22phox是构成 NOX2、NOX4、NOX5的基础亚基，p22phox能够间接反映NOX2、NOX4、NOX5的水平，p22phox与 NADPH氧化酶系密切相关[16-17]。NADPH氧化酶系在细胞组织处于应激状态时会过度地产生ROS，从而加重机体的氧化应激，说明NADPH氧化酶与ROS产生有直接关系。研究[18-19]表明，糖尿病患者单核细胞中ROS增多，同时会存在NOX2及p22phox激活的现象，且p22phox和MDA水平呈明显的正相关，总体说明NOX2及p22phox在整个机体氧化应激的过程中起主要作用，所以本实验首先通过 PCR法检测了胰腺组织中NOX2及p22phox的mRNA水平，实验结果表明，糖尿病大鼠胰腺组织NOX2及p22phox的mRNA水平会明显升高，说明糖尿病确实会诱导 NADPH氧化酶系的激活，而皮内针刺激足三里会使糖尿病大鼠 NOX2及p22phox的mRNA水平明显降低，说明皮内针刺激足三里对糖尿病氧化应激能够起到缓解作用。为了进一步考察NOX2及p22phox的变化，本实验又采用WB检测了NOX2及p22phox蛋白的变化情况，结果表明，糖尿病大鼠胰腺组织NOX2及p22phox蛋白的含量明显升高，说明糖尿病确实存在 NADPH氧化酶系的激活，由于 NOX的激活导致ROS过多积累进而诱发氧化应激，有研究[20]表明，NOX2在胰岛细胞中会有表达，但是在高糖的刺激下 NOX2会过度表达，本实验与之前的研究结果一致。比较糖尿病大鼠与皮内针刺激足三里大鼠胰腺组织NOX2及p22phox的蛋白水平，结果发现皮内针刺激足三里能明显抑制NOX2和p22phox表达水平。提示皮内针刺激足三里能调节糖尿病大鼠胰腺NOX2、p22phox蛋白表达水平进而影响糖尿病大鼠的氧化应激。

综上所述，本实验研究显示，2型糖尿病大鼠存在氧化应激，皮内针刺激足三里能够降低氧化应激的相关指标ROS及MDA，总体皮内针刺激足三里对2型糖尿病的损伤有明显改善作用，其作用机制是通过抑制氧化应激的上游调节因子NADPH氧化酶系中的NOX2及p22phox起作用。皮内针刺激足三里对于临床2型糖尿病的作用还有待进一步研究。