华夏TM白金PCR扩增试剂盒的法医学验证及STR遗传多态性调查

张建中，赵祖亮，李亮亮，李学博，刘增甲

（1.济宁医学院法医学与医学检验学院，山东 济宁272067；2.新疆维吾尔自治区阿勒泰地区公安局刑侦支队，新疆阿勒泰836500；3.山东政法学院 证据鉴识省级重点实验室，山东 济南250014；4.济宁医学院司法鉴定中心，山东济宁272067）

STR基因座因其具有高多态性，使法医DNA分析实现了高效、灵敏和快速的目标，在过去30年大量被应用到各类法医学鉴定中[1]。为便于国际间DNA数据的查询、交换和案件串并，20世纪90年代开始，美国联邦调查局（FBI）实施了联合检索系统（combined DNA index system，CODIS）计划，挑选出13个常染色体基因座作为核心基因座，2011年将核心基因座进行了调整补充形成了19个新的CODIS核心基因座[2]。近几年新开发的商品化STR分型试剂盒，大多以围绕CODIS核心基因座为基础进行研发构建[2-4]。

华夏TM白金PCR扩增试剂盒是美国Thermo Fisher Scientific公司推出的新一代6色荧光STR复合扩增试剂盒，除新的CODIS系统常染色体核心基因座外，试剂盒根据中国人群的群体遗传特点，又增加了Penta E、Penta D、TPOX、D6S1043和D22S1045常染色体STR基因座，并在性别染色体Amelogenin基因座的基础上，增加了Yindel（rs2032678）遗传标记，从而使其检测系统覆盖到25个基因座，其中常染色体基因座达到23个，其中涵盖了CODIS系统的全部核心位点和中国公安部国家DNA数据库常见的21个基因座，提高了检测效能，使检测结果具有更高的非父排除率和个体识别能力。

为了测试华夏TM白金PCR扩增试剂盒的检测性能和指标，评估其在法医学领域的应用价值，本研究按照美国DNA分析方法科学工作组（scientific working group on DNA analysis methods，SWGDAM）制定的确认指南[5]，分别从种属特异性、灵敏度、适应性、稳定性、混合样本、抑制剂和均衡性等方面对进行了测试。对山东地区383名汉族无关个体样本进行检测，并分析了23个常染色体STR基因座的遗传多态性信息，为法医学亲权鉴定和个人识别提供了相关数据。

1 材料与方法

1.1样品

常见生物性检材，包括FTA卡（长春博坤生物科技公司）、血样采集卡（苏州阅微基因技术有限公司）和普通滤纸血片各10份，唾液斑采集卡（公安部物证鉴定中心研制）10份，以及精斑、肌肉组织、肋软骨、毛发（有毛囊）及脱落细胞样本各10份，上述样本均来自日常检案（山东政法学院司法鉴定中心提供）。

常见动物猪、牛、羊、马、猫、犬、鸡、鸭、兔、鼠和鱼DNA（购自中国检验检疫科学研究院），大肠杆菌DNA（购自中国科学院微生物研究所），均按照说明书稀释至 1.0ng/μL 后备用。

按照知情同意的原则，血样采集卡采集山东地区汉族无关个体样本383份，供群体多态性调查使用。

1.2试剂

华夏TM白金PCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），AGCU EX22复合扩增试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司），AGCU 21+1复合扩增试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）及MR23复合扩增试剂盒（苏州阅微基因技术有限公司），实验测试标准样品9947A和007（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3DNA定量及PCR扩增

分 别 梯 度 稀 释 配 制 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng/μL 的 9947A 样品，1.0 ng/μL 的 007 样品以及1.0 ng/μL的常见动物 DNA样品和大肠杆菌DNA样品进行定量后检测。

按照华夏TM白金PCR扩增试剂盒说明书，对血痕及唾液斑样本以BSD600自动打孔机（澳大利亚BSD公司）采集1.2mm直径大小样本直扩，其余样本采用磁珠法提取上述样品的DNA，以NanoDrop2000型核酸蛋白检测仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）对DNA进行定量后待测，扩增以9700型PCR扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行直接扩增，扩增反应体系为25μL，其中PCR Mix 10μL，Primer 10μL，Prep-n-GOTM 缓冲液 5μL。其中 383份山东地区汉族无关个体样本

PCR 扩增参数:95℃ 1min；94℃ 3s，59℃ 16s，65℃ 29s，共 26个循环；60℃ 5min；4℃保持。

扩增产物经3500型遗传分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）检测，以GeneMapper ID-X软件进行分析数据。

1.4 测试指标

（1）种属特异性:常见动物猪、牛、羊、马、猫、犬、鸡、鸭、兔、鼠、鱼及大肠杆菌的 DNA，各取1 μL进行检测。

（2）灵敏度:标准样品9947A和007定量后，按上述浓度梯度分别进行扩增检测。

（3）适应性:提取上述血痕、唾液斑、精斑、肌肉组织、肋软骨、毛发（有毛囊）及脱落细胞样本的DNA，定量至 1.0 ng/μL 后各取 1 μL，按照说明书分别以华夏TM白金PCR扩增试剂盒和AGCU EX22复合扩增试剂盒进行检测，同时以AGCU EX22、AGCU 21+1及MR23复合扩增试剂盒进行DNA分型后结果比对。

（4）稳定性:将受试试剂盒中的复合扩增及检测试剂分装后，分别反复冻融20次，测试其有效性。

（5）均衡性:复合扩增样品 9947A，电泳分型后，按照基因型纯合子峰高除以2记录峰高，杂合子基因座的两等位基因，分别记录高峰与低峰峰高，并计算比值和均值。分别计算不同荧光中相同荧光所有基因座的峰高平均值，并与其他荧光组比较以确定不同荧光组间均衡性。

（6）混合样本:将质量浓度 1.0 ng/μL 的 9947A和 007 按 19∶1、9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶9、1∶19的体积比例混合，分别取样品1μL进行测试。

（7）抑制剂:①靛蓝测试。取240mmol/L的靛蓝与 1.0 ng/μL 的 9947A 等体积混合，取 1 μL 进行 3次检测。②钙离子测试。 取 0.5、1.0 和 2.0mmol/L 的钙离子，等体积加入到1.0 ng的9947A标准 PCR反应体系中，取1 μL进行3次检测。③血红素测试。 取 10、20、40、80 μmol/L 的血红素，等体积加入到 1.0 ng的 9947A标准 PCR 反应体系中，取 1 μL进行检测。

上述生物性检材、常见动物、大肠杆菌样品及试剂盒技术性能指标的检测分别由经专业培训的专业人员平行测试，共计重复3次。遗传多态性调查的山东地区汉族无关个体血样直接按照说明书进行DNA分型检测。

1.5 统计分析

以基因座峰值在200RFU以上，杂合子基因座两等位基因比≤2为有效分型，根据国际法医遗传学会（international society for forensic genetics,ISFG）进行等位基因命名[6-7]，标准样品9947A和007按照说明书提供的分型结果进行一致性比对，并对分型结果进行统计分析。同时利用Power Stats分析软件[8]统计山东地区汉族无关个体的群体数据，获得23个STR基因座各等位基因频率、杂合度（H）、匹配概率（Pm）、个人识别能力（DP）、非父排除率（PE）、多态信息含量（PIC）、累积个人识别能力（CDP）和累积非父排除率（CPE）等群体遗传学参数，采用Genepop version 4.2 软 件 （http://genepop.curtin.edu.au/）分析各基因座的基因型是否符合 Hardy-Weinberg平衡分布及各基因座之间是否存在连锁不平衡。

表1 华夏TM白金PCR扩增试剂盒及标准样品基因型信息

续表1

2 结果

2.1 技术指标验证

（1）种属特异性:常见动物猪、牛、羊、马、猫、犬、鸡、鸭、兔、鼠、鱼及大肠杆菌的DNA分型，均未获得特异性扩增产物和DNA分型。

（2）灵敏度:分别以 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5ng/μL 梯度稀释的模板量扩增 9947A，0.062 5ng/μL样品的DNA分型不完整，部分基因座峰值不能获得有效基因分型，0.125 ng及以上均可获得完整分型结果。

（3）适应性:对上述血痕、唾液斑、精斑、肌肉组织、肋软骨、毛发及脱落细胞样本均获得完整分型，且与对照试剂盒的检测分型结果完全一致。383份血卡和唾液斑样本亦均获得了有效基因分型。

（4）稳定性:受试试剂盒中的复合扩增及检测试剂分装反复冻融20次后，检测结果无差异。

（5）混合样本:007和9947A样品按上述比例混合后，9∶1及1∶9混合模式出现部分位点等位基因丢失现象（基因座峰值低于200RFU），其余混合均可获得完整DNA分型，不影响判读。

（6）抑制剂:按照上述浓度混合添加至PCR扩增体系的靛蓝、钙离子和血红素未影响DNA分型结果的正确判读。

（7）均衡性:样品9947A获得了有效基因分型，杂合子等位基因峰高比例均≥70%，各基因座峰高均衡性良好，同一荧光不同基因座间的峰高均衡性及不同荧光组之间峰高均衡性均≥50%。

图1 标准样品007DNA的STR分型图谱

2.2 遗传多态性数据

经对383名山东地区汉族无关个体23个STR基因座检测，共发现276个等位基因，其中Penta E基因座最高，检出24个等位基因，D16S539基因座最低，检出7个等位基因，各基因座的等位基因及其频率见表2。经2检验，23个常染色体STR基因座基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。 杂合度（H）在 0.627～0.930，个体识别能力（DP）在 0.783～0.986，非父排除率（PE）在0.324～0.856，多态性信息含量（PIC）在 0.551～0.916，累积个体识别能力（CDP）和累积非父排除率（CPE）分别为 0.999999999999999999999999998319和 0.999999999596233。相关等位基因频率分布及23个STR基因座群体遗传学参数详见表2～3。

表2 山东地区汉族人群23个STR基因座等位基因频率分布（n=383）

表3 山东地区汉族人群23个STR基因座群体遗传学参数

3 讨论

本研究结果显示，华夏TM白金PCR扩增试剂盒具有较好的种属特异性，检测灵敏度高（0.125 ng），对常见生物检材及混合样品具有很好的检测能力，相同检材不同试剂盒的DNA分型结果一致，抑制剂对PCR反应的影响小，试剂盒的稳定性及各荧光组的基因座间的均衡性都较高，具有较高的应用潜力。PCR复合扩增反应是实验的核心环节，常规PCR反应一般需耗时3 h，高效快速检测一直是法医工作者追求的目标[5]，华夏TM白金PCR扩增试剂盒在保证各项性能指标的前提下，将PCR复合扩增反应时间缩短到45 min，较大降低了检测时间，并可对血斑和唾液斑等生物检材直扩检测，在法医学检案中具有重要价值。

华夏TM白金PCR扩增试剂盒利用了六色荧光6-dyeTM技术，调整了各荧光范围内的基因位点布局，使得复合扩增体系可以同时检测25个基因座，是目前检测能力较高的试剂盒之一[3-4]，且涵盖19个CODIS核心基因座及国家数据库的21个STR位点，具有较高的数据库兼容性[10]。试剂盒设有12个Mini-STR基因座，扩增片段小于220 bp，可以对降解生物检材进行检测，提高了试剂盒的适用性。试剂盒同时具有Yindel和Amelogenin2个性别基因座，增强了男性个体因Y片段缺失、引物结合区突变而导致的性别误判情况[11]，与同类试剂盒相比Yindel性别基因座可以予以补充验证，可避免性别错判。试剂盒以中国人群为检测对象研发，并扩展了部分稀有等位基因Ladder和虚拟bins，方便检测样本DNA的分型判读，使检测结果更为明确。

用于个体识别和亲权鉴定的复合扩增试剂盒的系统效能需经过群体调查验证后方可使用，且群体数据的建立有助于法医学的应用[12]。因此，本研究还对山东地区汉族无关个体的群体数据进行了调查，23个常染色体STR基因座基因型频率均分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。通常情况下，同一染色体上物理距离超过10Mb的基因座没有连锁关系[13]，通过对23个基因座两两之间的连锁不平衡检验，显示所有基因座之间均不存在连锁不平衡现象。该群体遗传数据调查还发现，Penta E基因座检出的等位基因数量最多，其DP值最高（0.986），而TPOX基因座 DP值最低（0.783），与相关研究类似[14-16]。山东地区汉族383名无关个体23个STR基因座 H 值分布在 0.627～0.930，DP在 0.783～0.986，PE 在 0.324～0.856，PIC 在 0.551～0.916。 群体遗传数据的DP和PE反映了该遗传标记在法医学应用价值，当 DP＞0.7、PE＞0.5 时，可认为系高度多态性遗传标记[17]，经对该群体数据分析发现，其所有基因座的 DP值均＞0.7，83%的基因座（19个）PE 值＞0.5，显示了较高的群体多态性。本检测系统在山东地区汉族群体中平均杂合度大于0.790，平均多态信息量高于 0.761，而平均 DP在 0.920以上，PE也都超过了0.588。联合应用时其累积个体识别能力（CDP）为 0.999999999999999999999999998319，累积非父排除率（CPE）为 0.999999999596233。