阿那日五味散中化学成分定性鉴别及安石榴苷的含量测定

古丽巴哈尔·艾力，李蒙华，李玉玲，滕 亮

(新疆医科大学1药学院，乌鲁木齐，830011；2第一附属医院药学部，乌鲁木齐，830054)

阿那日五味散由石榴皮、肉桂、砂仁、荜茇、干姜5味药材组成，具有温胃、消食之功，临床上主要用于胃脘寒湿、消化不良、肾寒腰痛等症的治疗[1-2]。石榴皮多酚具有保护胃内粘膜的作用，石榴皮水浸物能够增强大鼠胃蛋白酶活性，促进胆汁分泌[3]，安石榴苷为其主要活性成分，具有抗氧化[4]、抗菌[5]、抗病毒[6]、抑制肿瘤细胞增殖等活性[7]。荜茇具有温中散寒，下气止痛的功效，胡椒碱为其主要成分，具有降脂[8]、抗肿瘤[9、抗抑郁[10]、抗胃溃疡[11]等作用。本研究建立了对方中胡椒碱的TLC鉴别方法，采用HPLC法测定方中安石榴苷的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-20AD 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-M20A 型光电二极管阵列紫外可见光检测器(日本岛津公司)，New Classic MF型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg)，KQ500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率100 KHz)，Milli-Q型艾柯超纯水仪(美国密理博公司)，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱(美国安捷伦公司)，LINOMAT5型半自动点样仪(瑞士CAMAG公司)，EPROSTAR3型薄层色谱数码成像系统(瑞士CAMAG公司)。

1.2 试药阿那日五味散(自制制剂，批号20170915；20171201；20180208；20180410；20180625)，安石榴苷对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-18030501，纯度≥98 %)，胡椒碱对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-17051210，纯度≥98 %)，硅胶G板(青岛海洋化工，批号20180412)，硅胶G板(烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂，批号20171104)，硅胶G板(安徽省良辰硅源材料有限公司，批号20180328)，甲醇(美国SIGMA公司，色谱纯)，水为纯化水，试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 阿那日五味散中胡椒碱的TLC鉴别称取阿那日五味散1.5 g，置于具塞锥形瓶中加入10 mL无水乙醇，超声30 min，滤过，即得供试品溶液。取胡椒碱对照品适量，加无水乙醇制成浓度为500 μg/mL的对照品溶液。按照处方配比和制备方法，制备1.5 g不含荜茇的阴性样品，同法制得为阴性样品溶液。分别取上述供试品溶液、阴性样品溶液各4 μL和对照品溶液3 μL，点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7∶2∶1)作为展开剂展开，取出，晾干，置于紫外灯366 nm下检视，结果供试品色谱图与对照品色谱图相同位置处显相同颜色的斑点，阴性样品色谱图中相同位置处无斑点，见图1。

注：1-5为样品，批号：20170915、20171201、20180208、20180410、20180625，6为阴性样品，7为胡椒碱对照品。图1 阿那日五味散TLC图

2.2 阿那日五味散中安石榴苷的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 称取安石榴苷对照品适量，制成浓度为531 μg/mL的甲醇溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取阿那日五味散0.1 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇超声提取30 min，放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，备用。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 称取不含石榴的阿那日五味散阴性样品0.1 g，按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，备用。

2.2.4 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇(流动相A)-0.1%三氟乙酸(流动相B)，梯度洗脱条件(0～10 min：A%为5%→20%，10～25 min：A%为20%→40%，25～35 min：A%为40%→65%，35～40 min：A%为65%)，进样量：10 μL，柱温：30℃，检测波长：370 nm，流速：1.0 mL/min。

2.2.5 专属性实验 取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液适量，按 “2.2.1”项下色谱条件测定，结果供试品中其他成分色谱峰对安石榴苷色谱峰无干扰，分离度大于1.5，理论塔板数按照安石榴苷峰计算均不低于6 000，拖尾因子为1.077，见图2-4。

图2 对照品HPLC色谱图(1.α-安石榴苷，2.β-安石榴苷)

图3 供试品HPLC色谱图(1.α-安石榴苷，2.β-安石榴苷)

2.2.6 回归方程的建立 取安石榴苷对照品溶液，依次倍量稀释，得梯度浓度的对照品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录α-安石榴苷、β-安石榴苷峰面积之和，以对照品浓度(X)与α-安石榴苷、β-安石榴苷峰面积之和(Y)进行线性回归，回归方程为：Y=5 563X-37 519，r=0.999 6，安石榴苷浓度在8.297～531.000μg/mL范围内，安石榴苷峰面积与浓度线性关系良好。

图4 阴性对照品HPLC色谱图

2.2.7 精密度实验 取供试品溶液适量，按“2.2.4”项下色谱条件连续测定6次，结果安石榴苷峰面积的RSD为1.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性实验 取供试品溶液适量，分别于不同放置时间0、2、4、6、8和9 h时，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，结果安石榴苷峰面积的RSD为1.7%，表明供试品溶液在9 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性实验 称取6份样品粉末，每份0.1 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.4”项下色谱条件进样，测定。结果样品中安石榴苷含量的RSD值为1.6%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率 称取6份已知安石榴苷含量的样品0.1 g，加入安石榴苷对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率及RSD值。平均回收率为98.3%，RSD为2.0%(n=6)，见表1。

2.2.11 含量测定 取5批阿那日五味散，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积值，计算安石榴苷的含量。5批阿那日五味散样品中安石榴苷含量在42.12～46.48 mg/g，平均含量为(44.48±1.73)mg/g，见表2。

表1 加样回收率(n=6)

表2 5批阿那日五味散中安石榴苷含量测定结果(n=5)

3 讨论

本研究在对荜茇的TLC鉴别中，考察了不同检视条件[12-13]、不同波长[14-15]以及不同显色剂[16-17]对色谱结果的影响，结果表明在紫外366 nm直接检视的效果优于喷显色剂后的检视效果，最终确定直接在紫外灯366 nm下检视。

安石榴苷对照品溶液紫外-可见区全波长扫描结果显示，安石榴苷于258 nm、370 nm处均有较强的紫外吸收，以258 nm为检测波长的HPLC图谱表明样品中的其他物质峰与安石榴苷分离度不符合色谱系统适用性的要求，在370 nm处α-安石榴苷和β-安石榴苷响应值虽相对较低，但二者与其它物质色谱峰分离度较好，因此确定安石榴苷的检测波长为370 nm。

本研究在预实验中考察了多种流动相体系下的目标成分色谱行为[18-20]，结果表明以甲醇-0.1%三氟乙酸溶液作为流动相，可使分离效果和峰形得到改善。同时由于安石榴苷分子量大，结构中含有较多酚羟基，易受空气、光线、温度等的影响而发生结构变化。因此，在样品制备过程中须采取低温避光保存等措施，以保证分析结果的准确性。本研究所建立的方法简便、可行、准确，适用于阿那日五味中化学成分的定性鉴别及安石榴苷的含量测定。